利用B細(xì)胞抗體類(lèi)別轉(zhuǎn)換模型進(jìn)行A-EJ修復(fù)通路的研究.pdf

1、保持基因組的完整性和穩(wěn)定性對(duì)于生物體的存活是至關(guān)重要的。DNA雙鏈斷裂(DSB)是所有DNA損傷中最為嚴(yán)重的一種，可以通過(guò)外界因素（如電離輻射和化學(xué)誘變劑）和內(nèi)源因素（如內(nèi)源性DNA氧化以及DNA復(fù)制壓力）產(chǎn)生。哺乳動(dòng)物體內(nèi)的DSB修復(fù)方式主要有兩種:依賴(lài)于同源序列的同源重組(HR)和不依賴(lài)于同源序列的非同源末端連接(NHEJ)。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)典的非同源末端連接(C-NHEJ)缺失的情況下，DSB末端仍然可以被有效地修復(fù)，預(yù)示著

2、非經(jīng)典末端連接(A-EJ)修復(fù)通路的存在。A-EJ活性已經(jīng)在多種系統(tǒng)中得到證實(shí)，特別是在C-NHEJ核心因子（如DNA連接酶Ⅳ）缺陷的B細(xì)胞中，A-EJ介導(dǎo)的垮H基因座位置的抗體類(lèi)別轉(zhuǎn)換(CSR)效率是野生型細(xì)胞的50％。
　　大量研究已經(jīng)證實(shí)A-EJ的顯著特點(diǎn)是對(duì)微同源序列(MH)的偏好性，以及在染色體轉(zhuǎn)位過(guò)程中的重要作用。雖然目前已經(jīng)有多個(gè)蛋白因子被報(bào)道參與A-EJ過(guò)程，但是其結(jié)果往往存在爭(zhēng)議，特別是對(duì)參與A-EJ修復(fù)的DNA

3、連接酶的研究還很不清楚。
　　本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在Lig4缺陷的小鼠B細(xì)胞系CH12F3中完全敲除Lig1或者細(xì)胞核內(nèi)的Lig3，建立只含有單個(gè)DNA連接酶（分別為L(zhǎng)ig3和Lig1）的CH12F3細(xì)胞系。令人驚訝的是，只含有Lig1或Lig3的CH12F3細(xì)胞仍然具有A-EJ活性，可以有效地催化IgH基因座的CSR過(guò)程以及同一條染色體上由CRISPR/Cas9產(chǎn)生的DSB之間的染色體缺失;并且其活性與Lig1

4、/Lig3同時(shí)存在的細(xì)胞沒(méi)有明顯差別。然而，在催化染色體轉(zhuǎn)位方面，含有Lig1和Lig3的復(fù)合物顯示出不同的特性。完全敲除細(xì)胞核中的Lig3，Lig4-/-細(xì)胞的染色體轉(zhuǎn)位明顯減少，而在完全敲除Lig1的細(xì)胞中則沒(méi)有這種變化。另外，染色體轉(zhuǎn)位連接處微同源序列的分析揭示了不同DNA連接酶催化活性的特異性。這些數(shù)據(jù)表明存在多種含DNA連接酶的復(fù)合物用以催化A-EJ過(guò)程。
　　另外，本研究在小鼠B細(xì)胞中建立了CRISPR/Cas9高通量

5、篩選方法，在野生型和Lig4缺陷的細(xì)胞中篩選參與CSR過(guò)程中DSB修復(fù)的基因。首先建立了Cas9穩(wěn)定表達(dá)的CH12F3細(xì)胞系（野生型和Lig4缺陷型），并對(duì)sgRNA篩選的整個(gè)過(guò)程進(jìn)行了優(yōu)化。利用優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件，在Cas9穩(wěn)定表達(dá)的WT和Lig4-/-CH12F3細(xì)胞中進(jìn)行sgRNA文庫(kù)的高通量篩選。對(duì)不同細(xì)胞群中的sgRNA進(jìn)行高通量測(cè)序，通過(guò)MAGeCK分析方法，篩選IgA陽(yáng)性細(xì)胞群中顯著減少和IgA/IgM雙陰性細(xì)胞群中顯著增加的