濾泡輔助性T細胞促進IgAN患兒IgA抗體類別轉換及Gd-IgA1生成.pdf

1、第一部分IgAN患兒外周血Tfh檢測及mIgA,IL-21,TGFβ1的表達
　　目的：探討濾泡T輔細胞(Tfh)及其細胞因子IL-21,TGFβ1和mIgA,在IgAN患兒(含原發(fā)和繼發(fā)性IgA腎病即紫癜性腎炎,IgAN)外周血中的表達情況。方法：IgA腎病患兒根據(jù)用藥情況分為初治未用藥組、免疫抑制治療組,20例初治未用藥IgAN患兒,34例免疫抑制劑治療IgAN患兒納入研究,22例正常兒童作對照。用流式細胞術檢測外周血中Tfh

2、(CXCR5+CD4+)在CD4+T淋巴細胞中的比例,淋巴細胞膜表面mIgA在CD19+細胞中的表達水平,采用RT-PCR檢測淋巴細胞IgA基因CHα1和CHα2表達水平,elisa檢測血清Tfh細胞分泌因子IL-21和TGFβ1的表達。結果：(1)未用藥組患兒外周血Tfh為(19.87％±1.00%),免疫抑制治療組為(13.87%±0.83%),正常對照組為(10.28%±0.68%)。統(tǒng)計檢驗表明,三者間均數(shù)差異均有顯著意義(P<

3、0.001)。(2)IgA腎病患兒CD19陽性淋巴細胞中mIgA表達(13.21±0.85)顯著高于正常對照組(8.75±0.32),P<0.0001。IgA腎病患兒外周血淋巴細胞IgA基因CHα1和CHα2表達高于對照患兒.(3)IgA腎病患兒血清細胞因子IL-21為102.2±9.5(pg/ml),明顯高于正常兒童74.38±2.6(pg/ml),P<0.05.TGFβ1為80392±2274(pg/ml),顯著高于正常兒童2938

4、4±1828(pg/ml),P<0.05。結論：初步發(fā)現(xiàn)在IgAN患兒外周血中Tfh和細胞分泌因子以及mIgA的表達顯著增多,提示Tfh可能在該疾病IgA產(chǎn)生中起作用,免疫抑制治療可以明顯降低Tfh在CD4+T淋巴細胞中的比例。
　　第二部分IgAN患兒Tfh促進B細胞IgA抗體類別轉換
　　目的：體外探討IgAN患兒Tfh誘導B細胞IgA抗體類別轉換的作用。方法：磁珠分選初治未用藥IgAN患兒及正常兒童外周血中的Tfh和初

5、始B細胞(Na?veBcells,NB)共培養(yǎng),通過real-timeRT-PCR檢測共培養(yǎng)體系基因TGF-β1、IL-21、Bcl-6、Blimp-1、AID、Iα1Cα1、Iα2Cα2和Ir3Cr3以及普通RT-PCR檢測IgM(CHμ),IgA(CHα1,CHα2)和IgG(CHr)基因動態(tài)表達情況。ELISA檢測共培養(yǎng)上清液IL-21,TGF-β1和IgA在不同時間點的表達量,流式細胞術檢測共培養(yǎng)淋巴細胞mIgA,mIgM在CD

6、19+淋巴細胞中的表達變化。激光共聚焦顯微鏡觀察共培養(yǎng)細胞及單純NB分別添加Tfh細胞因子TGF-β1、IL-21、IL-4后mIgA的表達。結果：IgAN患兒組TGF-β1,IL-21,Bcl-6,Blimp-1,AID,Ia2Ca2,Ia1Ca1基因表達均在第6小時最強,并隨時間減弱;抗體類別轉換產(chǎn)物CHμ、CHα1、CHα2、CHγ在第6小時表達最強,并隨時間表達逐漸減少,對照組基因無時序表達差異。患者組和對照組共培養(yǎng)的細胞mIg

7、A、IL-21,TGF-β1及IgA表達隨時間而增多,在第9天以后與對照組相比分別為8.16±0.07vs.5.1±0.77(%),15.17±1.6vs.5.5±1.3(pg/ml),1059±64.86vs.528±36.05(pg/ml),4.2±1.1vs.1.8±0.9(pg/ml)(P均<0.05)。共聚焦結果顯示Tfh細胞因子TGF-β1、IL-21、IL-4促進NB細胞IgA表達;Tfh與NB共培養(yǎng)顯著促使IgA表達。結

8、論：體外實驗顯示IgAN患兒Tfh細胞有促進NB細胞發(fā)生IgA抗體類別轉換,促其向分化為IgA分泌細胞分化的作用,Tfh細胞分泌的細胞因子IL-21,TGF-β1,IL-4等可能參與這一誘生過程,因此,Tfh在IgAN發(fā)病中起重要作用。
　　第三部分IgAN患兒Tfh及其細胞因子誘導B細胞分泌半乳糖缺乏的IgA1
　　目的：觀察IgA腎病患兒體內(nèi)外半乳糖缺乏的IgA1的表達情況,探討Tfh細胞及其細胞因子致IgA缺陷的可能機

9、制。方法：收集IgAN患兒和正常兒童外周血,磁珠分選IgA腎病患兒外周血NB和Tfh細胞,elisa測定NB和Tfh共培養(yǎng)組,單獨NB細胞加IL-21或TGF-β1或IL-4等Tfh細胞因子培養(yǎng)組12天培養(yǎng)上清液及IgAN腎病患兒和正常兒童外周血血清IgA和半乳糖缺乏的IgA1(galactose-deficientIgA1,Gd-IgA1)水平。結果：IgAN患兒外周血血清Gd-IgA1水平為2573±540.2(U/ml),顯著高于

10、正常兒童1021±132.5(U/ml),P=0.03。IgAN患兒血清IgA為2881±611(ug/ml),稍高于正常兒童2337±428(ug/ml),但無統(tǒng)計學差異(p=0.47)。IgAN患兒NB和Tfh共培養(yǎng)細胞上清液IgA水平4.82±0.39(ug/ml),顯著高于NB與IL-21培養(yǎng)組2.28±0.26(ug/ml),NB與TGF-β1培養(yǎng)組2.4±0.27(ug/ml),NB與IL-4培養(yǎng)組2.02±0.32(ug/

11、ml),P值均<0.001。IgA腎病患兒NB和Tfh共培養(yǎng)組Gd-IgA1與IgA比值為4.04±0.32(U/ug),顯著低于NB與IL-21培養(yǎng)組7.73±1.31(U/ug),NB與TGF-β1培養(yǎng)組7.56±1.13(U/ug),NB與IL-4培養(yǎng)組8.64±1.23(U/ug),P值均<0.05.結論：IgA腎病患兒存在明顯的IgA1分子半乳糖缺陷,Tfh細胞及相關細胞因子在誘生B細胞產(chǎn)生半乳糖缺陷IgA1過程中起關健的調(diào)節(jié)