Peyer小結(jié)中濾泡輔助性T細胞誘導B細胞分化成分泌IgA的漿細胞參與IgA腎病機制.pdf

1、本文內(nèi)容分為五部分進行介紹：
　　第一部分
　　IgAN動物模型的制備、鑒定及免疫組化
　　目的：用黏膜免疫誘導法構(gòu)建 IgAN動物模型,以此模型為基礎,探討 IgAN的發(fā)病機制及Peyer小結(jié)在 IgAN中的作用。方法：雄性 BALB/C小鼠,給予牛血清白蛋白、注射葡萄球菌腸毒素 B誘導 IgAN模型。第0周、6周、12周分別用代謝籠收集24小時尿液測定24小時尿蛋白,并尿沉渣紅細胞計數(shù)。12周去眼球收集血清,測定血

2、清總蛋白(TP)、白蛋白(Alb)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、半胱氨酸蛋白酶抑制劑 C(Cys C);腎組織 IgA免疫熒光;腎組織 HE、PAS及DAB染色;Peyer小結(jié) IgA、Bcl-6免疫組化。結(jié)果：(1)IgAN組和Control組第0w、6w、12w24h尿蛋白定量分別為(0.61±0.26)mg vs(0.67±0.22)mg、(3.61±0.75)mg vs(0.77±0.27)mg、(4.15±0.82)mg

3、vs(1.09±0.51)mg,IgAN組第0w24h尿蛋白定量與對照相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05),第6w、12w24h尿蛋白定量分別高于 Control組(P<0.01)。IgAN組和Control組第0w、6w、12w尿沉渣紅細胞計數(shù)分別為(1.90±1.20)個/HP vs(1.30±0.95)個/HP、(1.80±0.92)個/HP vs(1.50±1.08)個/HP、(2.50±1.18)個/HP vs(2.00±0.82

4、)個/HP,IgAN組第0w、6w、12w尿沉渣紅細胞計數(shù)與 Control組相比均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(2)IgA免疫熒光顯示 IgAN組40只小鼠有33只系膜區(qū)有 IgA沉積,Control組40只小鼠僅有2只腎小球有少量 IgA沉積,IgA沉積于腎小球系膜區(qū),呈典型顆粒狀分布。(3)與 Control組相比,IgA組血清 Alb降低(P<0.05), Cys C升高(P<0.05),TP、BUN、Cr無統(tǒng)計學差異(P>0

5、.05)。(4)Peyer小結(jié) IgA、Bcl-6免疫組化顯示兩者陽性細胞主要分布于生發(fā)中心亮區(qū)與暗區(qū)交界處,半定量分析顯示IgAN組兩者染色較 Control組增強,差異有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結(jié)論：牛血清白蛋白、葡萄球菌腸毒素聯(lián)用可成功誘導 IgAN模型,是較為理想的構(gòu)建 IgAN模型的方法,同時提示黏膜免疫可能參與了IgAN的發(fā)生。
　　第二部分
　　IgA分泌細胞在 Peyer小結(jié)中的分化及Tfh細胞的調(diào)

6、節(jié)作用
　　目的：觀察分泌 IgA的B細胞在 Peyer小結(jié)中的發(fā)育及分化過程,說明 Peyer小結(jié)在分泌 IgA的B細胞分化過程中的重要作用,以及濾泡輔助性 T細胞調(diào)節(jié) B細胞分化成分泌 IgA漿細胞的意義。方法：在 IgAN模型中,分離小腸壁上的Peyer小結(jié),收集細胞于試管中。分管如下:①空白管(僅有細胞);②細胞+ CXCR5-APC;③細胞+CD4-PE;④細胞+ CXCR5-APC+ CD4-PE;⑤細胞+ IgA-F

7、ITC;⑥細胞+ B220-PerCP;⑦細胞+ IgM-PE-Cy7;⑧細胞+ IgA-FITC+B220-PerCP+ IgM-PE-Cy7;⑨細胞+100ulPBS+ APC-CXCR5(4ul)+ PE-CD4(4ul)(IgAN);⑩細胞+100ulPBS+FITC-IgA(4ul)+ PerCP-B220(2.0ul)+ PE-Cy7-IgM(1.25ul)(IgAN)。流式細胞儀測定 Peyer小結(jié)中Tfh(CXCR5+C

8、D4+)細胞、B220+IgM+B淋巴細胞、B220+IgA+B淋巴細胞、B220-IgA+漿母細胞、IgA的百分率。結(jié)果：IgAN模型組和Control組 Tfh細胞、B220+IgM+B淋巴細胞、B220+IgA+B淋巴細胞、B220-IgA+漿母細胞、IgA百分率分別為10.6％±2.49％ vs4.88％±1.41％、34.7％±11.1％ vs24.3％±7.84％、7.92％±2.21％ vs5.75％±2.10％、5.57

9、％±1.75％ vs3.74％±1.46％、13.5％±3.62％ vs9.49％±2.14％。IgAN組 Tfh細胞和IgA百分率與對照相比有顯著的統(tǒng)計學意義(P<0.01), B220+IgM+B淋巴細胞、B220+IgA+B淋巴細胞、B220-IgA+漿母細胞分別高于 Control組(P<0.05)。結(jié)論：在 IgAN模型鼠Peyer小結(jié)中Tfh細胞百分率增加,提示 Tfh細胞在介導 B細胞分化成為分泌 IgA的漿細胞中起調(diào)節(jié)作

10、用;Peyer小結(jié) B細胞發(fā)育并向分泌 IgA漿母細胞生成明顯占優(yōu)勢,是 IgA漿母細胞生成的主要部位,為 B細胞向分泌 IgA的漿母細胞轉(zhuǎn)化和IgAN發(fā)病提供了微環(huán)境。
　　第三部分
　　Peyer小結(jié)中Tfh細胞功能測定
　　目的：測定 Peyer小結(jié)中抗牛血清白蛋白(抗-BSA)抗體水平,間接反映 Peyer小結(jié) Tfh細胞功能,探討 IgA腎病 Peyer小結(jié)中Tfh細胞功能的改變。方法：分離 Peyer小結(jié),

11、磁珠分選 Peyer小結(jié)中的CXCR5+CD4+細胞,與自體脾細胞共培養(yǎng),第8天Western blot測定上清液抗-BSA含量反映 Tfh細胞的功能。結(jié)果：IgAN模型組和Control組細胞培養(yǎng)上清液抗-BSA表達水平分別為0.58±0.10 vs0.31±0.08。IgAN組 Peyer小結(jié)抗-BSA濃度較 Control組升高,差異有統(tǒng)計學意義(t=2.97,P=0.01)。結(jié)論：IgAN中,Peyer小結(jié) Tfh細胞不僅百分率

12、增加,而且功能明顯增強,進一步提示Tfh細胞在介導 B細胞分化成為分泌 IgA的漿細胞中起重要的調(diào)節(jié)作用。
　　第四部分
　　Peyer小結(jié)中Tfh細胞相關轉(zhuǎn)錄因子和細胞因子的表達
　　目的：測定 Peyer小結(jié) Tfh細胞分泌因子白細胞介素-21(IL-21)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1) mRNA的表達,測定 IL-21、Bcl-6、Blimp-1蛋白質(zhì)的表達。探討 Tfh細胞相關細胞因子的功能及它們在 Ig

13、AN中的作用。方法：分離 Peyer小結(jié),提取總 RNA、合成 cDNA及進行熒光定量 PCR反應,測定 IL-21和TGF-β1 mRNA的表達。分離 Peyer小結(jié),提取組織蛋白,Western blot測定 IL-21、Bcl-6、Blimp-1蛋白質(zhì)的表達。結(jié)果：IgAN組和Control組 IL-21和TGF-β1 mRNA相對表達值分別為1.67±0.13 vs1.49±0.13、1.21±0.09 vs1.10±0.10。

14、IgAN組 IL-21和TGF-β1 mRNA相對表達值較 Control組升高,差異分別有統(tǒng)計學意義(t=2.730,P=0.016;t=2.416,P=0.03)。IgA組 IL-21,Bcl-6和Blimp-1相對蛋白質(zhì)的表達值分別為0.67±0.21,0.60±0.19和1.03±0.07;Control組 IL-21, Bcl-6和Blimp-1相對蛋白質(zhì)的表達值分別為0.45±0.10,0.34±0.21和0.67±0.07

15、。IgAN組 IL-21、Bcl-6和Blimp-1蛋白質(zhì)相對表達值較 Control組升高,差異分別有統(tǒng)計學意義(t=2.628,P=0.025;t=2.665,P=0.019;t=10.128,P=0.000)。結(jié)論：IgA腎病 Peyer小結(jié) Tfh細胞相關轉(zhuǎn)化因子和細胞因子表達增加,促進 B細胞向分泌 IgA的漿細胞分化,Peyer小結(jié)中Tfh細胞及其相關細胞因子可能參與 IgA腎病的發(fā)病。
　　第五部分
　　Tfh

16、細胞相關細胞因子促進初始 B細胞分化成熟并分泌半乳糖缺乏的IgA1
　　目的：觀察 IgA腎病患兒初始 B細胞在 Tfh細胞相關因子作用下的誘導成熟過程,探討 Tfh細胞在 IgAN發(fā)病機制中的作用。方法：磁珠分選 IgA腎病患兒外周血初始 B細胞(CD27-IgD+),加 IL-21和TGF-β1等細胞因子共培養(yǎng),測定細胞培養(yǎng)上清液 J鏈的表達、IgA分泌、半乳糖缺乏的IgA1(Gd-IgA1)水平。結(jié)果：IgA腎病組和Cont

17、rol組 J鏈的表達相對值、IgA分泌、異常糖基化的IgA1分別為(0.85±0.16)vs(0.63±0.28)、(6.64±0.85) pg/ml vs(6.43±0.51) pg/ml、(85.93±7.91) U/ml vs(73.1±8.24)U/ml。IgAN組 J鏈的表達和IgA分泌水平與對照組相比較無統(tǒng)計學意義(t=1.914,P=0.076;t=0.592,P=0.563),而IgAN組 Gd-IgA1水平較Contr