人類IgA腎病中T細(xì)胞免疫失衡及其作用的研究.pdf

1、IgA腎病是全球范圍內(nèi)最常見的原發(fā)性腎小球腎炎之一，本病起病隱匿，臨床表現(xiàn)多樣化，有30％-40％的患者會在10-25年內(nèi)進(jìn)展至終末期腎病，最終需要。腎臟替代治療。因此，闡明IgAN的發(fā)病機(jī)理是重要的研究方向，對制定有效特異的治療干預(yù)方案有積極的影響。 IgAN的始發(fā)因素是腎小球系膜區(qū)IgA沉積，其中主要是多聚IgAl沉積，伴或不伴IgG、C3沉積。近來研究發(fā)現(xiàn)，IgAN患者血清中及系膜區(qū)沉積的IgA1均存在O-連接糖基化異常，

2、這種異常糖基化的結(jié)構(gòu)使IgA1易于形成多聚體或與IgG形成免疫復(fù)合物，從而更易于在系膜區(qū)沉積，引起腎小球炎癥和損傷。因而認(rèn)為血清IgA1的增多及低糖基化的結(jié)構(gòu)異常可能是IgAN的重要致病因素。目前低糖基化IgA1增多的機(jī)制尚不明確。 IgA1由多克隆活性B細(xì)胞生成，而B細(xì)胞分泌IgA1的過程受T細(xì)胞調(diào)控，因此T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)功能的紊亂可能導(dǎo)致失控的B細(xì)胞產(chǎn)生過量及異常的IgA1。以往研究發(fā)現(xiàn)IgAN中存在Th1/Th2的失衡，但對

3、是Th1還是Th2占優(yōu)勢仍有爭議，多數(shù)研究認(rèn)為Th2占優(yōu)勢，但仍有部分研究持不同結(jié)論，而Th1/Th2失衡在IgAN中的作用亦尚未闡明。在大鼠動物模型中的研究發(fā)現(xiàn)，Th2類細(xì)胞因子不僅可促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgA，其異常增加還可導(dǎo)致IgA分子N-糖基化的異常。但Th2對人IgA1分子O-連接糖基化異常的影響尚需進(jìn)一步證實(shí)。 CD4+CD25high調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一個(gè)具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，對自身抗原和外來抗原引發(fā)的免疫反應(yīng)均具有

4、免疫調(diào)節(jié)作用，是機(jī)體維持免疫耐受的重要機(jī)制之一。叉頭框蛋白3是其特異的功能調(diào)節(jié)蛋白，可在一定程度上反映CD4+CD25highTreg的水平和功能活性，被認(rèn)為是CD4+CD25highTreg的特征性標(biāo)志之一。近年來CD4+CD25highTreg在腫瘤、移植、感染以及自身免疫性疾病發(fā)病中的作用受到廣泛關(guān)注，對腫瘤抗原逃逸、移植抗原耐受、感染病原體的慢性持續(xù)均起重要調(diào)節(jié)作用，但在IgAN中的作用鮮見報(bào)道。 本研究旨在觀察調(diào)節(jié)性T

5、細(xì)胞及輔助性T細(xì)胞在IgAN患者外周血中的變化，Treg等淋巴細(xì)胞在腎臟局部的浸潤情況，并分析其與臨床病理資料間的相關(guān)性，同時(shí)通過體外實(shí)驗(yàn)，觀察Th2對IgAN患者外周單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生IgAl及其糖基化的影響。通過這些研究初步探討這兩群T淋巴細(xì)胞在IgAN發(fā)病及進(jìn)展機(jī)制中的作用，為臨床治療策略提供新的思路及理論基礎(chǔ)。 第一部分調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在人類IgA腎病中的變化及作用 第1章IgA腎病患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化

6、目的：觀察IgAN患者外周血中CD4+CD25highTreg的變化，探討其與臨床病理的關(guān)系。 方法：2007年7月至2007年12月在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院。腎內(nèi)科經(jīng)腎活檢確診的IgAN患者，排外過敏性紫癜、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、乙肝病毒相關(guān)性腎炎及肝硬化等繼發(fā)性原因，1個(gè)月內(nèi)未使用激素及免疫抑制劑；健康對照為健康獻(xiàn)血者，無腎臟病史及腎臟病家族史。檢測患者24小時(shí)尿蛋白定量、尿紅細(xì)胞位相畸形紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血尿酸、血IgA、血肌酐、血脂等

7、臨床指標(biāo)，并根據(jù)較正的MDRD公式計(jì)算腎小球?yàn)V過率。觀察腎組織形態(tài)學(xué)改變和免疫熒光表達(dá)等病理指標(biāo)，并參照KatafuchiIntegralCalculusStandardforIgANephropathy對細(xì)胞增殖、小球硬化、新月體、間質(zhì)細(xì)胞浸潤、小管萎縮及間質(zhì)纖維化進(jìn)行半定量評分。 流式細(xì)胞術(shù)檢測IgAN患者外周血中CD4+CD25highTreg的分布頻率，并通過胞內(nèi)染色技術(shù)檢測FOXP3的表達(dá)，用Spearman或Pear

8、son相關(guān)分析方法對CD4+CD25highTreg的分布變化與IgAN各項(xiàng)臨床及病理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。 結(jié)果：IgAN患者外周血CD4+CD25highTreg占CD4+T細(xì)胞的百分比高于健康對照者，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且CD4+CD25highTreg高表達(dá)FOXP3。IgAN患者外周血CD4+FOXP3+T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的百分比也較正常對照組明顯升高，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD4+CD25highTreg的分

9、布頻率與血IgA水平呈正相關(guān)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)，未發(fā)現(xiàn)與尿蛋白、血尿程度、血尿酸及各項(xiàng)病理指標(biāo)有相關(guān)性。 小結(jié)：IgAN患者外周血中CD4+CD25highTreg增多，其分布頻率與血IgA水平呈正相關(guān)，eGFR呈負(fù)相關(guān)。 第2章FOxP3在IgA腎病患者腎組織中的表達(dá) 目的：觀察FOXP3、CD4、CD8、CD20在IgAN患者腎組織中的表達(dá)，探討其與臨床以及病理的關(guān)系。 方法：對50例IgAN患者腎

10、組織石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色檢測FOXP3、CD4、CD8、CD20的表達(dá)，利用電子圖像分析系統(tǒng)測量小管間質(zhì)面積，計(jì)算單位面積小管間質(zhì)中淋巴細(xì)胞數(shù)目。收集臨床指標(biāo)，并對細(xì)胞增殖、小球硬化、新月體、小管萎縮及間質(zhì)纖維化病理參數(shù)進(jìn)行半定量評分。采用Spearman相關(guān)分析方法對各種淋巴細(xì)胞的表達(dá)數(shù)目與各項(xiàng)臨床指標(biāo)及病理參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。 結(jié)果：IgAN患者腎組織中淋巴細(xì)胞浸潤區(qū)可見FOXP3、CD4、CD8、CD20的表達(dá)，F(xiàn)OX

11、P3在淋巴細(xì)胞胞核上表達(dá)，CD4、CD8、CD20在淋巴細(xì)胞胞膜及胞漿表達(dá)。這些表達(dá)陽性的淋巴細(xì)胞主要浸潤于小管間質(zhì)區(qū)，多呈灶狀分布于硬化小球的周圍，偶見小球內(nèi)浸潤。 結(jié)合臨床病理資料分析，F(xiàn)OxP3+、CD4+、CD8+、CD20+細(xì)胞數(shù)均與腎穿時(shí)的eGFR呈負(fù)相關(guān)，與血尿酸呈正相關(guān)，與24小時(shí)尿蛋白定量呈正相關(guān)，與細(xì)胞增殖評分呈正相關(guān)，與小球硬化評分呈正相關(guān)，與間質(zhì)纖維化呈正相關(guān)，與小管萎縮呈正相關(guān)。其中CD8+、CD20+

12、細(xì)胞數(shù)與新月體形成有關(guān)。 小結(jié)：IgAN患者腎臟小管間質(zhì)區(qū)可見FOXP3+、CD4+、CD8+、CD20+淋巴細(xì)胞浸潤，其細(xì)胞數(shù)與腎穿時(shí)的eGFR呈負(fù)相關(guān)，與血尿酸、24小時(shí)尿蛋白定量、細(xì)胞增殖程度、小球硬化、間質(zhì)纖維化、小管萎縮均呈正相關(guān)。 第二部分輔助性T細(xì)胞在人類IgA腎病中的變化及作用 第1章IgA腎病患者外周血輔助性T細(xì)胞亞群的變化 目的：觀察IgAN患者外周血中Th1、Th2分布頻率的變化，及

13、Th1/Th2比值的變化，探討其與臨床病理的關(guān)系。 方法：2007年8月至2007年12月在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科經(jīng)腎活檢確診的IgAN患者，排外過敏性紫癜、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、乙肝病毒相關(guān)性腎炎及肝硬化等繼發(fā)性原因，1個(gè)月內(nèi)未使用激素及免疫抑制劑；健康對照為健康獻(xiàn)血者，無腎臟病史及腎臟病家族史。收集患者各項(xiàng)臨床指標(biāo)，對細(xì)胞增殖、小球硬化、新月體、間質(zhì)細(xì)胞浸潤、小管萎縮及間質(zhì)纖維化等病理參數(shù)進(jìn)行半定量評分。 結(jié)果：IgA

14、N患者外周血Th1占CD3+T細(xì)胞的百分比為14.04±4.11％，較正常對照組的16.25±6.16％減少，但兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Th2的百分比為2.57±0.72％，較正常對照組的1.81±1.10％增高，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IgAN患者存在Th1/Th2失衡，Th1/Th2比值明顯下降，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IgAN患者外周血中Th2分布頻率與血IgA水平呈正相關(guān)，與eGFR呈負(fù)相關(guān)，與其他指標(biāo)無相關(guān)性。Th1及Th

15、1/Th2比值與各項(xiàng)臨床病理指標(biāo)間均未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。 小結(jié)：IgAN患者體內(nèi)存在Th1/Fh2失衡，表現(xiàn)為以Th2為優(yōu)勢，且Th2的分布頻率與血IgA水平呈正相關(guān)，eGFR呈負(fù)相關(guān)。 第2章Th2對IgA腎病患者IgA1糖基化異常的影響 目的：體外觀察Th2對IgAN患者外周單個(gè)核細(xì)胞分泌IgA1及其糖基化的影響，探討Th2在IgAN免疫發(fā)病機(jī)制中的作用。 方法：Ficoll法分離IgAN患者及正常對照者的

16、PBMC，部分通過免疫磁珠分選法去除Th2，分為PBMC、去除Th2的PBMC兩組，每組均設(shè)空白對照，以美洲商陸絲裂原為淋巴細(xì)胞體外培養(yǎng)的刺激劑，體外刺激培養(yǎng)7天后，收集細(xì)胞上清，用ELISA方法檢測IgA1的濃度。用凝集素ELISA法檢測糖基化及唾液酸化水平，以IgA1與蠶豆凝集素的單位結(jié)合力代表半乳糖基化水平，與花生凝集素的單位結(jié)合力代表唾液酸化水平。兩組問差別采用t檢驗(yàn)。 結(jié)果：IgAN患者PBMC去除Th2后，分泌IgA

17、1的平均濃度較未去除組明顯下降，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IgAN患者及正常人PBMC去除Th2與未去除組比較，PBMC分泌的IgA1與VVL、PNA的單位結(jié)合力均無顯著差別。 小結(jié)：Th2促進(jìn)IgAN患者PBMC分泌IgA1增多，但對IgA1分子的半乳糖基化水平及唾液酸化水平無明顯影響。 結(jié)論： 1.IgAN患者外周血中CD4+CD25highTreg增多，可能引起異常IgA1的清除障礙，參與IgAN的發(fā)病機(jī)制。