應(yīng)用短擴(kuò)增子ASPCR技術(shù)對(duì)FFPET進(jìn)行SNP基因分型的研究.pdf

1、福爾馬林固定石蠟包埋組織(Formalin Fixed and Paraffin EmbeddedTissues，F(xiàn)FPET)是病理學(xué)、法醫(yī)病理學(xué)等學(xué)科進(jìn)行疾病診斷和科學(xué)研究的常用檢材，多被長時(shí)期的保存而成為一種重要的個(gè)人實(shí)物檔案，為解決涉嫌保險(xiǎn)欺詐、醫(yī)療糾紛、財(cái)產(chǎn)繼承等民事或刑事案件提供了一種極為重要的、可靠的法醫(yī)物證檢材。基于CODIS系統(tǒng)13個(gè)STR位點(diǎn)的P1us和Cofiler等試劑盒，雖已廣泛應(yīng)用于血液、唾液、上皮組織、發(fā)根及

2、骨組織的基因分型，但是對(duì)FFPET進(jìn)行基因分型時(shí)，常因組織固定過程中各種理化因素的影響致使DNA高度降解，從而難以獲得穩(wěn)定、可靠的分型結(jié)果。 研究表明，福爾馬林固定時(shí)間、切片厚度以及不同的脫蠟方法均可影響FFPET提取DNA的質(zhì)量，從而影響其基因分型。通過優(yōu)化蛋白酶消化條件，精簡DNA提取步驟和純化DNA模板雖能提高DNA純度和減少DNA額外損傷，但并不能給FFPET的基因分型帶來本質(zhì)的改觀；通過增加循環(huán)次數(shù)或采用巢式PCR等對(duì)

3、PCR方法進(jìn)行調(diào)整與改良，可以提高擴(kuò)增產(chǎn)物量或擴(kuò)增特異性，但并未明顯改善其檢出率。因此，越來越多的學(xué)者將研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn)移到如何有效地縮短擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度，以克服FFPET檢材中DNA嚴(yán)重降解對(duì)基因分型的影響，從而提高FFPET基因分型的成功率。各大公司競相研發(fā)出擴(kuò)增片段較小的miniSTR商品化檢測試劑盒，提高了對(duì)降解DNA檢材的分型成功率，但仍然普遍存在諸如等位基因或位點(diǎn)丟失、不平衡峰、偽峰等問題，影響了在實(shí)際檢案中的應(yīng)用。 單

4、核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)具有數(shù)量豐富、突變率低、適合高通量自動(dòng)化檢測的特點(diǎn)，被認(rèn)為是更具應(yīng)用前景的第三代法醫(yī)學(xué)遺傳標(biāo)記。由于SNP基因座的檢測對(duì)檢材DNA的完整性要求不高，50～100bp的DNA片段就可以滿足其分型的需要，從而為解決FFPET基因分型的難題提供了新的思路和途徑。本研究以保證擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度小于100bp為基本條件，針對(duì)具有較高雜合度的SNP基因座(rs1454

5、361)自行設(shè)計(jì)等位基因特異性引物，建立了檢測rs1454361基因座多態(tài)性的等位基因特異性擴(kuò)增(Allele Specific PCR，ASPCR)方法，調(diào)查了rs1454361基因座在遼寧漢族群體的頻率分布；通過rs1454361基因座與D8S1179基因座對(duì)FFPET檢材基因分型結(jié)果的比較，探討采用短擴(kuò)增子ASPCR技術(shù)對(duì)FFPET進(jìn)行SNP分型的可行性與優(yōu)越性，進(jìn)而為解決此類高度降解DNA檢材的基因分型問題開拓一種新的途徑。

6、 材料與方法: 1、選取3具冰凍尸體，分別取肺、骨骼肌、腦組織塊按常規(guī)方法制作FFPET樣品，同時(shí)取尸體心臟血液各2ml作為陽性對(duì)照；152例中國遼寧地區(qū)漢族無血緣關(guān)系個(gè)體血樣。 2、采用短擴(kuò)增子ASPCR技術(shù)建立rs1454361基因座分型系統(tǒng)，檢測該基因座在中國遼寧地區(qū)漢族群體樣本中的多態(tài)分布，直接計(jì)數(shù)法計(jì)算其基因型頻率與等位基因頻率，并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。采用PowerStatesV12軟

7、件計(jì)算其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用指標(biāo)。 3、采用紫外分光光度計(jì)與瓊脂糖凝膠電泳對(duì)FFPET樣本的DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測。 4、分別應(yīng)用短擴(kuò)增子ASPCR技術(shù)與PCR-STR技術(shù)對(duì)FFPET檢材進(jìn)行基因分型，并對(duì)兩者的分型成功率與分型效果進(jìn)行比較。 結(jié)果: 1、152例中國遼寧地區(qū)無血緣關(guān)系個(gè)體中：TT、TA和AA三種基因型頻率分別為0.2632、0.4671和0.2697；等位基因T的頻率為0.4967，A為0.5033。

8、采用x<'2>檢驗(yàn)法進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)的結(jié)果為：x<'2>=0.657(P>0.05)。采用PowerStatesV12軟件統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果：其雜合度為(H)0.467，個(gè)人識(shí)別幾率(DP)為0.640，偶合幾率(Pm)為0.360，非父排除率(PE)為0.160，多態(tài)信息含量(PIC)為0.375。 2、采用紫外分光光度計(jì)對(duì)FFPET樣品進(jìn)行檢測，其OD<,260>/OD<,280>均分布在1.6～1.8。4

9、張切片組的DNA模板濃度約140 μ g/ml～1g/ml，1張切片組的DNA模板濃度約20～80μg/ml。 3、瓊脂糖凝膠電泳顯示，F(xiàn)FPET的DNA片段長度主要分布于200bp以下，其中肺臟與骨骼肌FFPET樣品的DNA在100bp附近有顯亮條帶，部分腦組織FFPET樣品的DNA降解程度更加嚴(yán)重，片段長度主要分布于50bp以下。另外，在上樣量相同的情況下，1張切片組DNA譜帶的熒光強(qiáng)度明顯低于4張切片組． 4、本研

10、究共18個(gè)FFPET樣品。所有FFPET樣品的PCR-STR(D8S1179基因座)分型結(jié)果均無法正確判型，而采用短擴(kuò)增子ASPCR技術(shù)(rs1454361基因座)分型后，4張切片組正確檢出率為7/9；1張切片組的正確檢出率為4/9。其中，腦組織來源FFPET樣品的正確檢出率較低，僅4張切片組中有一例正確檢出。 結(jié)論: 1、福爾馬林固定7天的FFPET樣品提取的DNA高度降解，其片段長度主要分布在200bp以下，集中于1