線粒體基因復(fù)合擴(kuò)增進(jìn)行種屬鑒定的研究.pdf

1、目的:生物性檢材的種屬鑒定是法醫(yī)物證學(xué)主要研究?jī)?nèi)容之一。本課題針對(duì)線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)編碼序列的保守區(qū)和可變區(qū)在人與哺乳動(dòng)物間的異同，設(shè)計(jì)并建立穩(wěn)定可靠的種屬鑒定體系，探索一種適合法醫(yī)學(xué)實(shí)踐的，快速、靈敏、簡(jiǎn)便而實(shí)用的種屬鑒別方法，以解決當(dāng)前種屬鑒定中存在的不足。 方法:針對(duì)本課題的研究目的，對(duì)mtDNA 的37個(gè)基因進(jìn)行研究，制定目的基因篩選原則，遵循該原則篩選出合適的編碼基因，根據(jù)

2、建立復(fù)合擴(kuò)增體系的要求，建立穩(wěn)定可靠的線粒體基因復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)體系。復(fù)合擴(kuò)增產(chǎn)物用非變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳(PAGE)、硝酸銀染色技術(shù)進(jìn)行種屬鑒定。為驗(yàn)證該系統(tǒng)的穩(wěn)定性以及在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中的可行性，進(jìn)行了包括系統(tǒng)靈敏度檢測(cè)、不同環(huán)境下樣本的檢測(cè)、形成于不同基質(zhì)上樣本的檢測(cè)和陳舊樣本等的檢測(cè)，從而對(duì)其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行評(píng)估。 結(jié)果:根據(jù)mtDNA兩個(gè)編碼基因設(shè)計(jì)cyt b和ND6兩對(duì)引物進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，PAGE-銀染顯色。結(jié)果顯示

3、為兩條電泳條帶者為人的樣本，兩條帶分別為cyt b基因片段(358bp)和ND6基因片段(181bp)；顯示為一條電泳條帶者為動(dòng)物樣本，對(duì)應(yīng)為cyt b基因片段(358bp)。本方法最小檢出：DNA模板量為0.25pg，遠(yuǎn)高于其他方法，因此尤其適合于法醫(yī)學(xué)上微量檢材的檢測(cè)。將本研究建立的cyt b/ND6復(fù)合擴(kuò)增體系檢測(cè)處于不同環(huán)境下的實(shí)驗(yàn)樣本。結(jié)果顯示，在4℃、室溫和37℃環(huán)境條件下，檢材經(jīng)過(guò)120天后，本方法均可正確區(qū)分人和動(dòng)物樣本

4、。而將檢材置于風(fēng)干機(jī)內(nèi)、室內(nèi)和模擬的潮濕環(huán)境，結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)90天后，對(duì)置于室內(nèi)和風(fēng)干機(jī)內(nèi)的檢材進(jìn)行檢測(cè)，本方法均可正確區(qū)分人和動(dòng)物樣本；而在模擬的高度潮濕環(huán)境中，放置50天的檢材的PCR產(chǎn)物電泳條帶已略微弱于放置30天的檢材，而放置90天的樣本無(wú)可見(jiàn)的條帶。餐巾紙、棉簽、塑料薄膜、塑料泡沫、水泥地面、白墻面、泥土、窗簾布上的血痕，本方法均獲得了正確的檢測(cè)結(jié)果。對(duì)于陳舊樣本的檢測(cè)，本方法能正確鑒別四川成都地區(qū)室溫下放置7年～9年的血痕樣本