應(yīng)用SNP分型技術(shù)對漢坦病毒宿主動物遺傳特征的研究.pdf

1、目的：了解河北省腎綜合征出血熱疫源地鼠種構(gòu)成、帶毒率及宿主動物所攜帶漢坦病毒與遺傳特性間的關(guān)系，指導(dǎo)本病的預(yù)防和控制。
　　 方法：
　　 1 疫源地調(diào)查，夾夜法捕鼠，無菌取鼠肺；
　　 2 用冷凍切片機切鼠肺，冷丙酮固定，間接免疫熒光法篩選漢坦病毒陽性鼠肺；
　　 3 從陽性和陰性鼠肺中提取總RNA；
　　 4 根據(jù)文獻以及GENBANK 中已知的SNP 位點查找特異性引物，用等位基因特異性引物

2、聚合酶鏈反應(yīng)(ASP-PCR)進行擴增，并進行電泳和觀察結(jié)果；
　　 5 根據(jù)電泳結(jié)果，對SNP 位點進行分型，分析基因多態(tài)性特征。通過病例對照研究(Case-control Study)分析HV 宿主動物單核苷酸多態(tài)性與宿主動物HV 攜帶狀態(tài)的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1 鼠間疫情資料顯示褐家鼠占總捕獲鼠種的64.90[％]，是河北省的優(yōu)勢鼠種。河北省居民區(qū)鼠種主要為褐家鼠和小家鼠，分別占居民區(qū)總捕獲鼠種的7

3、3.38[％]和24.10[％]；野外鼠種主要為褐家鼠、大倉鼠和小家鼠，分別占野外總捕獲鼠種的54.72[％]、20.75[％]和13.21[％]。河北省居民區(qū)鼠密度為2.16[％]，高于野外鼠密度(0.53[％])。
　　 2 將527份鼠肺冷凍切片，冷丙酮固定后用間接免疫熒光法檢測，陽性鼠肺共17份,陽性率為3.23[％]。提示我省腎綜合征出血熱疫源地鼠帶毒率較低，帶毒鼠為宅區(qū)褐家鼠，野外及其它鼠種未檢出。
　　 3

4、 rs8153609 位點等位基因和基因型頻率在各研究組中的分布：根據(jù)Hardy-Weinberg 平衡公式檢驗，攜帶HV與未攜帶HV 兩組標(biāo)本中均存在C、T 兩種等位基因，推算出CC、CT、TT 三種基因型的理論頻數(shù)(預(yù)期值)，結(jié)果顯示χ2=1.339，p=0.512>0.05，說明實際基因型頻率與期望基因型頻率的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，其分布符合Hardy-Weinberg 平衡，有較好的群體代表性。
　　 Rs8153609

5、位點基因型與等位基因頻率的比較結(jié)果顯示，HV 攜帶組和未攜帶組rs8153609 位點CC基因型頻率分別為0[％]和28.13[％]，TT基因型頻率分別為21.74[％]和25.00[％]，CT基因型頻率分別為78.26[％]和46.87[％]，CC、TT基因型頻率HV 攜帶組低于未攜帶組，CT基因型頻率HV 攜帶組明顯高于未攜帶組(χ2=8.729，P=0.009<0.05)，基因型頻率差異有顯著性。提示rs8153609 位點的基因

6、型可能與HV 感染相關(guān)，CT基因型的存在可能會增加宿主動物感染HV的機會。HV 攜帶組和未攜帶組rs8153609 位點C 等位基因頻率分別為39.13[％]和51.56[％]，T 等位基因頻率分別為60.87[％]和48.44[％]，統(tǒng)計學(xué)分析沒有顯著性差異(χ2=1.663，P=0.197>0.05)。Rs8153609 位點C和T 等位基因頻率在HV 攜帶組和未攜帶組中未發(fā)現(xiàn)差別。
　　 Rs8153609 位點不同基因型

7、與HV 攜帶狀態(tài)的比較結(jié)果顯示，CT基因型標(biāo)本HV的感染率為54.55[％]，CC基因型及TT基因型標(biāo)本HV的感染率為22.73[％]，CT基因型標(biāo)本HV的感染率明顯高于CC基因型及TT基因型標(biāo)本HV的感染率(χ2=5.493，P=0.019＜0.05)。CT基因型標(biāo)本感染HV的危險性是CC基因型及TT基因型標(biāo)本感染HV的4.08 倍(OR=4.080，95[％]CI為1.21 7～13.680)。
　　 進一步分析不同地域宿主

8、動物rs8153609 位點CT基因型頻率分布是否存在差別，東北部地區(qū)(張家口、承德、唐山、秦皇島)和中南部地區(qū)(保定、石家莊、滄州、邯鄲)rs8153609 位點CT基因型頻率分別為64.29[％]和55.56[％]，東北部地區(qū)CT基因型頻率較高，但統(tǒng)計學(xué)分析沒有顯著性差異(χ2=0.437，P=0.509>0.05)，因此本次實驗中，尚沒有發(fā)現(xiàn)不同地域宿主動物rs8153609 位點CT基因型頻率分布有差別。
　　 4 rs

9、8174936 位點等位基因頻率及基因型頻率在各研究組中的分布：攜帶與未攜帶HV 兩組標(biāo)本中均存在C、T 兩種等位基因和CC、CT、TT 三種基因型，將各實際觀察值代入Hardy-Weinberg 平衡公式進行檢驗結(jié)果顯示：χ2=3.988，p=0.136；即p 值大于0.05，說明實際基因型頻率與期望基因型頻率的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，其分布符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性。
　　 HV 攜帶組和未攜帶組rs8

10、174936 位點CC基因型頻率分別為21.74[％]和24.24[％]，TT基因型頻率分別為13.04[％]和6.06[％]，CT基因型頻率分別為65.22[％]和69.70[％]，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析(χ2=0.818，P=0.761>0.05)，基因型頻率無顯著性差異。Rs8174936 位點的三種基因型頻率在HV 攜帶組和未攜帶組中的分布無差異。HV 攜帶組和未攜帶組rs8174936 位點C 等位基因頻率分別為52.17[％]和59.

11、09[％]，T 等位基因頻率分別為47.83[％]和40.91[％]，統(tǒng)計學(xué)分析沒有顯著性差異(χ2=0.527，P=0.468>0.05)。即rs8174936 位點的C和T 等位基因頻率在HV 攜帶組和未攜帶組中的分布沒有差異。
　　 Rs8174936 位點不同基因型與HV 攜帶狀態(tài)的比較結(jié)果顯示，CC基因型及CT基因型標(biāo)本HV的感染率為39.22[％]，TT基因型標(biāo)本HV的感染率為60.00[％]，雖然TT基因型標(biāo)本HV

12、的感染率略高于CC基因型及CT基因型標(biāo)本HV的感染率，但統(tǒng)計學(xué)分析無顯著性差異(P=0.392>0.05，F(xiàn)isher's Exact Test)。本次試驗中還不能認為該位點與宿主動物HV攜帶狀態(tài)相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1 褐家鼠、小家鼠是河北省居民區(qū)主要鼠種，褐家鼠、大倉鼠和小家鼠是野外主要鼠種。褐家鼠是河北省的優(yōu)勢鼠種，并且是腎綜合征出血熱的主要傳染源。
　　 2 rs8153609 位點的基因多態(tài)性可能