玉米轉(zhuǎn)基因新方法的研究.pdf

1、轉(zhuǎn)基因玉米是目前種植面積最廣的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。國(guó)內(nèi)外許多機(jī)構(gòu)都致力于玉米轉(zhuǎn)基因的研究，目前，玉米轉(zhuǎn)基因方法主要采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和基因槍法，但是這兩種方法都需要經(jīng)過組織培養(yǎng)，不僅花費(fèi)高耗時(shí)長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因效率不高，且受受體基因型限制。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者還嘗試了電泳法、胚芽鞘針刺法、超聲波法等DNA直接導(dǎo)入方法，有的方法還申請(qǐng)了國(guó)家發(fā)明專利。但是這些方法的轉(zhuǎn)基因機(jī)理尚不明確，也沒有得到廣泛應(yīng)用。本文以蘇玉19為材料，開展了以花粉為受體的玉米轉(zhuǎn)基因新方

2、法研究，探索了采用農(nóng)桿菌浸染玉米離體花粉培養(yǎng)法和超聲波處理法將外源基因?qū)胗衩谆ǚ郏ㄟ^授粉直接獲得轉(zhuǎn)基因玉米種子的技術(shù)體系。通過對(duì)花粉培養(yǎng)基、花粉培養(yǎng)溫度、萌發(fā)時(shí)間、農(nóng)桿菌浸染時(shí)間以及超聲波處理的強(qiáng)度、時(shí)間、去污劑等技術(shù)因子進(jìn)行了探索和優(yōu)化，初步建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的外源基因?qū)腚x體萌發(fā)花粉的玉米轉(zhuǎn)基因新方法。主要結(jié)果如下:
　　1.建立了一套完善的玉米花粉采集、保存、培養(yǎng)技術(shù)體系，使得離體玉米花粉萌發(fā)率達(dá)到60％以上。通過對(duì)玉米花

3、粉采集和保存方法的比較，發(fā)現(xiàn)在大田里取玉米雄蕊而獲得的花粉比在大田中直接采集的花粉萌發(fā)率高;將花粉于低溫下貯藏比室溫下貯藏的活力高。因此，我們選擇在上午9-10點(diǎn)，由玉米雄蕊旗葉下20cm左右剪斷，放在冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，取1小時(shí)內(nèi)散出的花粉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。比較不同培養(yǎng)基對(duì)玉米花粉萌發(fā)的影響，結(jié)果表明，300 mg/L Ca(NO3)2·4H2O，100 mg/L H3BO3，200 mg/LMgSO4·7H2O，100 mg/L KNO3為最

4、佳基本培養(yǎng)基;對(duì)蔗糖濃度從10％到40％進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)花粉在不同的蔗糖培養(yǎng)基中均可以萌發(fā)，但在15％的蔗糖溶液中萌發(fā)率相對(duì)較高;在花粉培養(yǎng)基中加入15％PEG4K，發(fā)現(xiàn)花粉在加入15％ PEG4K的培養(yǎng)基中萌發(fā)率明顯提高;通過對(duì)培養(yǎng)溫度的探索，發(fā)現(xiàn)花粉在27℃時(shí)萌發(fā)率大于30℃;對(duì)花粉體外萌發(fā)的時(shí)間進(jìn)行探索，發(fā)現(xiàn)花粉在培養(yǎng)0.5h萌發(fā)率最高。因此，玉米花粉應(yīng)在最佳培養(yǎng)基中添加15％蔗糖，以及15％ PEG4K，27℃培養(yǎng)0.5h。

5、>　　2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因?qū)胗衩左w外萌發(fā)花粉的研究:以綠色熒光蛋白(GFP)為報(bào)告基因，研究了三種不同農(nóng)桿菌菌株(EHA105、GV3103、LBA4404)、兩種不同去污劑(Silwet-L77、Tween20)、三種農(nóng)桿菌濃度（OD600為0.4、0.6、0.8）以及五個(gè)不同的農(nóng)桿菌與花粉共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)離體培養(yǎng)花粉轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):在培養(yǎng)基中添加Silwet-L77，農(nóng)桿菌浸染10min時(shí)，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高。三種菌株介

6、導(dǎo)的轉(zhuǎn)化率沒有太大的差異。以Bar基因?yàn)閳?bào)告基因，將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的花粉進(jìn)行授粉，獲得T0代種子。對(duì)T0代玉米幼苗分別進(jìn)行了草丁膦抗性鑒定和Bar基因PCR檢測(cè)，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化率從0-7.27％都有分布，平均達(dá)到2.22％。Southern雜交檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化植株的基因組DNA中有Bar基因插入。
　　3.超聲波介導(dǎo)DNA直接轉(zhuǎn)化離體花粉的研究:通過對(duì)超聲波處理強(qiáng)度、時(shí)間、次數(shù)等因素進(jìn)行試驗(yàn)，試圖建立一套優(yōu)化的方法體系。以Bar基因?yàn)閳?bào)告