二甲雙胍局部注射緩解神經(jīng)病理性疼痛的研究.pdf

1、背景:神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain,NPP),是由軀體感覺系統(tǒng)疾病或損傷引起的慢性疼痛綜合征。其病因復雜,是一種極其復雜的臨床綜合征,對醫(yī)藥工作者構(gòu)成了巨大的挑戰(zhàn)。目前,臨床上常用的治療藥物包括抗抑郁藥、抗癲癇藥、局部麻醉藥,阿片類鎮(zhèn)痛藥以及非甾體類抗炎藥物等,但治療效果很不理想。因此,探索神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生機制,尋找新的治療靶點,迫在眉睫。
　　目前,關(guān)于神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機制有許多研究:神經(jīng)炎癥成為解釋

2、該綜合征的主流學說,神經(jīng)炎癥對于疼痛中樞敏化的調(diào)節(jié)也成為疼痛領(lǐng)域中的熱點問題。令人惋惜的是,臨床試驗結(jié)果證明,無論是膠質(zhì)細胞抑制劑還是CCR2受體抑制劑,均未能表現(xiàn)出任何顯著的鎮(zhèn)痛效果。因此,與基礎(chǔ)研究的導向不同,臨床試驗結(jié)果提示利用神經(jīng)炎癥抑制來鎮(zhèn)痛的思路可能并不可行。因而要攻克這一疾病,要求我們另辟蹊徑,尋求別的解決思路。
　　巨噬細胞是一種非常重要的免疫細胞,主要通過固有免疫保護宿主并且在炎癥過程中對死亡細胞進行吞噬性清除。

3、巨噬細胞至少可以分為兩種活化類型,相應(yīng)地M1極化抑制細胞增殖并產(chǎn)生組織損傷和炎癥,而M2型極化則發(fā)揮抗炎和組織修復功能。且巨噬細胞尤其是M2亞型,在傷口愈合和神經(jīng)再生中扮演著非常重要的角色。巨噬細胞存在著分型的轉(zhuǎn)化,即在M1-M2狀態(tài)之間變化。通常認為,在損傷修復的不同階段,巨噬細胞會經(jīng)歷動態(tài)的變化過程:M1型極化巨噬細胞對于損傷后炎癥反應(yīng)的觸發(fā)十分關(guān)鍵,而轉(zhuǎn)換為M2極化型則對于炎癥消除和受損組織的再生至關(guān)重要。
　　另外,包含單

4、核/巨噬細胞在內(nèi)的免疫細胞中也含有內(nèi)源性阿片肽。基于巨噬細胞以上的兩點特性,即:一、該細胞至少存在兩種功能狀態(tài),在M1型時發(fā)揮促炎、免疫吞噬的作用,而在M2狀態(tài)下卻具有抗炎并促進組織修復的作用;二、在特定狀態(tài)下,這類細胞可以釋放強效鎮(zhèn)痛的內(nèi)源性阿片肽;我們推測巨噬細胞尤其M2型巨噬細胞對于NPP的治療有著無限潛力?；谝陨?我們初步形成科學假說:即通過“馴養(yǎng)”巨噬細胞,釋放更多的內(nèi)啡肽,從而同時發(fā)揮促修復和鎮(zhèn)痛的作用,緩解頑固性神經(jīng)病理

5、性疼痛。
　　目的:本研究我們試圖通過在局部（神經(jīng)損傷部位）激動AMPK,誘發(fā)巨噬細胞釋放內(nèi)啡肽來治療神經(jīng)病理性疼痛,并探討其中可能的具體細胞和分子機制。
　　方法:(1)利用CCI整體動物模型,考察神經(jīng)病理性疼痛中,二甲雙胍局部注射能否對經(jīng)典的疼痛行為學指標——機械性縮足反射閾值產(chǎn)生影響。(2)選取巨噬細胞殺傷劑氯膦酸鹽脂質(zhì)體,阿片受體拮抗劑納洛酮和μ型阿片受體抑制劑CTAP以及AMPK抑制劑Compound C作為工具藥

6、物預(yù)處理,對正常大鼠進行局部神經(jīng)周注射,考察對二甲雙胍鎮(zhèn)痛作用的影響,并探索其可能的分子機制。(3)在骨髓來源的原代巨噬細胞BMDM完成全部的細胞實驗,WB方法檢測p-AMPK,p-p38等蛋白的水平,Elisa試劑盒測定BMDM細胞上清中的β-內(nèi)啡肽含量。(4)使用免疫熒光的方法檢測分子機制。(5) Co-IP免疫共沉淀的方法檢測BMDM中AMPK-TAB1-p38復合物的形成。
　　結(jié)果:(1)二甲雙胍局部神經(jīng)周注射可以顯著改

7、善大鼠CCI模型引起的神經(jīng)病理性疼痛。(2)巨噬細胞殺傷劑氯膦酸鹽脂質(zhì)體,阿片受體拮抗劑納洛酮和μ型阿片受體抑制劑CTAP以及AMPK抑制劑Compound C(CC)都能明顯抑制二甲雙胍產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛作用。(3)細胞Western Blot實驗顯示,二甲雙胍刺激后BMDM中的p38MAPK和AMPK磷酸化水平明顯上升;BMDM上清中β-內(nèi)啡肽的含量顯著上升,而p38 MAPK抑制劑SB203580和AMPK抑制劑CC都能取消這種上升。(4