骨橋蛋白對(duì)β1,4GalT-Ⅰ表達(dá)的影響及在細(xì)胞間黏附作用的相關(guān)性研究.pdf

1、目的:探究β1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶-1(β1，4GalT-Ⅰ)和骨橋蛋白(OPN)在圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)規(guī)律;分析OPN和β1，4GalT-Ⅰ在人體子宮內(nèi)膜的表達(dá)、定位情況;檢測(cè)人OPN重組蛋白(rhOPN)在模擬著床期子宮內(nèi)膜RL95-2細(xì)胞中對(duì)β1，4GalT-Ⅰ表達(dá)的影響;分析rhOPN蛋白調(diào)節(jié)β1，4GalT-Ⅰ表達(dá)時(shí)所涉及的相關(guān)通路分子;檢測(cè)rhOPN蛋白和β1，4GalT-ⅠsiRNA分別調(diào)控體外胚胎著床模型中子宮內(nèi)膜β

2、1，4GalT-Ⅰ的表達(dá)和對(duì)胚胎與子宮內(nèi)膜黏附的影響。
　　 方法:建立小鼠早孕模型，收取圍著床期妊娠小鼠(D1-D5)子宮內(nèi)膜，分別提取子宮內(nèi)膜蛋白和RNA，用Real-timePCR和Western-blot檢測(cè)圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜中β1，4GalT-Ⅰ和OPN的表達(dá)情況;采集臨床增生期、分泌期子宮內(nèi)膜標(biāo)本，分析OPN和β1，4GalT-Ⅰ在人體子宮內(nèi)膜的定位情況;采用人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞(RL95-2)模擬著床前接受態(tài)子宮內(nèi)膜

3、，通過(guò)rhOPN蛋白刺激RL95-2細(xì)胞，采用Real-timePCR和Western-blot方法檢測(cè)不同濃度、不同時(shí)間條件下rhOPN蛋白對(duì)β1，4GalT-Ⅰ表達(dá)的影響，并確定最佳rhOPN作用條件（時(shí)間，濃度）;在最佳條件下，檢測(cè)參與rhOPN蛋白對(duì)β1，4GalT-Ⅰ調(diào)控表達(dá)的相關(guān)信號(hào)通路，并采用相關(guān)信號(hào)分子的特異性抑制劑，通過(guò)Real-timePCR和Western-blot方法檢驗(yàn)相關(guān)信號(hào)通路;利用人源的絨毛癌細(xì)胞(JAR

4、)模擬胚泡與RL95-2細(xì)胞組成體外著床模型，用β1，4GalT-ⅠsiRNA干擾RL95-2細(xì)胞中β1，4GalT-Ⅰ的表達(dá)，通過(guò)活細(xì)胞熒光標(biāo)記JAR細(xì)胞，分別通過(guò)熒光顯微鏡和流式細(xì)胞計(jì)數(shù)分析β1，4GalT-Ⅰ表達(dá)下調(diào)后，rhOPN蛋白對(duì)RL95-2細(xì)胞和JAR細(xì)胞間黏附的影響。
　　 結(jié)果:在圍著床期小鼠(D1-D5)子宮內(nèi)膜中，OPN和β1，4GalT-Ⅰ在蛋白和RNA水平的表達(dá)呈現(xiàn)一致性，D1-D4逐漸升高，在妊娠第4

5、天（D4;著床窗口期）達(dá)到峰值，然后在孕D5下降。
　　 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，OPN和β1，4GalT-Ⅰ在人子宮內(nèi)膜組織腺體周?chē)磉_(dá)，且分泌期表達(dá)強(qiáng)于增生期。
　　 不同濃度，不同時(shí)間條件下，rhOPN蛋白刺激RL95-2細(xì)胞表達(dá)β1，4GalT-Ⅰ逐漸增強(qiáng)，在200ng/ml、2h時(shí)β1，4GalT-Ⅰ的表達(dá)最強(qiáng);選擇rhOPN最佳作用條件，檢測(cè)參與增強(qiáng)β1，4GalT-Ⅰ表達(dá)的相關(guān)信號(hào)通路分子，發(fā)現(xiàn)在rhOPN蛋

6、白刺激下，Erk1/2、AKT(thr308)、p38的活化和IκBα的降解均增強(qiáng);分別加入以上4種通路分子的特異性抑制劑后發(fā)現(xiàn)當(dāng)Erk1/2、AKT、NF-κB的活性受到抑制時(shí)，rhOPN蛋白對(duì)β1，4GalT-Ⅰ的表達(dá)上調(diào)作用均受到不同程度的抑制，而抑制p38活性時(shí)，rhOPN蛋白對(duì)β1，4GalT-Ⅰ的表達(dá)并無(wú)影響;
　　 在體外細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)中，與未處理組相比，rhOPN蛋白能夠提高RL95-2細(xì)胞對(duì)JAR細(xì)胞的黏附率。當(dāng)

7、用β1，4GalT-ⅠsiRNA下調(diào)RL95-2細(xì)胞中β1，4GalT-Ⅰ的表達(dá)后，JAR細(xì)胞在RL95-2細(xì)胞上的粘附率下降。下調(diào)β1，4GalT-Ⅰ后再加入rhOPN蛋白，JAR細(xì)胞的黏附率升高且與未處理組相比無(wú)明顯差別。
　　 結(jié)論:β1，4GalT-Ⅰ和OPN在圍著床期小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)相似性，且均在分泌期子宮內(nèi)膜腺體中高表達(dá)，提示β1，4GalT-Ⅰ和OPN共同參與了胚胎著床的過(guò)程;
　　 OPN可能通過(guò)活化E