Egr-1與骨橋蛋白在大鼠血管平滑肌細(xì)胞中的相關(guān)性及其機(jī)制的研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化性疾病、血管重建術(shù)后再狹窄(restenosis，RS)、高血壓等血管重塑相關(guān)性疾病已經(jīng)愈來(lái)愈嚴(yán)重地威脅著人類的健康。目前認(rèn)為，血管中膜平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cell，SMC)向內(nèi)膜下遷移與增殖是血管重塑的主要病理基礎(chǔ)之一。 研究表明，某些轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors，TF)可以調(diào)節(jié)多個(gè)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)增殖相關(guān)

2、基因的表達(dá)，從不同層面調(diào)控VSMC的遷移與增殖。同時(shí)，人們也逐漸注意到細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在血管重塑過(guò)程中的重要地位。研究發(fā)現(xiàn)，ECM在各種外界刺激的作用下，可以作為細(xì)胞外信號(hào)，經(jīng)跨膜信號(hào)傳遞系統(tǒng)到達(dá)核內(nèi)，激活一系列調(diào)控VSMC增殖的TF，從而推動(dòng)VSMC的分裂、遷移及增殖。TF與ECM在血管重塑的過(guò)程中密不可分，因此將二者有機(jī)地聯(lián)系在一起，并對(duì)其相互作用關(guān)系進(jìn)行深入探討，將有助于全面了解血管重

3、塑的細(xì)胞與分子機(jī)制。 早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子—1(early growth response factor—1，Egr—1)作為一種鋅指結(jié)構(gòu)TF，參與多種基因的調(diào)控，與細(xì)胞增殖關(guān)系密切。大量研究表明，Egr—1在介導(dǎo)VSMC遷移、增殖過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，成為目前血管重塑機(jī)制研究中的焦點(diǎn)。骨橋蛋白(osteopontin，OPN)作為ECM中一種重要的功能性蛋白，被認(rèn)為是血管損傷重塑過(guò)程中重要的始動(dòng)因素，應(yīng)用抗OPN抗體可以抑制VS

4、MC的表型轉(zhuǎn)化、遷移和增殖。盡管Egr—1和OPN在介導(dǎo)VSMC遷移、增殖過(guò)程中均起著重要的作用，但二者之間的關(guān)系尚不清楚。 本課題擬在以往研究的基礎(chǔ)上，對(duì)培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈VSMCs分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Egr—1、OPN基因，并檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后OPN與Egr—1的表達(dá)變化，從而分析二者的相關(guān)性。并應(yīng)用染色質(zhì)免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation，ChIP)方法檢測(cè)Egr—1與OPN啟動(dòng)子的結(jié)合情況，同時(shí)通過(guò)向O

5、PN穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中加入細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal—regulated kinase，ERK)的磷酸化抑制劑，檢測(cè)抑制ERK磷酸化后，OPN上調(diào)Egr—1的水平變化，從而對(duì)Egr—1與OPN相關(guān)性的內(nèi)在機(jī)制進(jìn)行深入探討，并為抑制VSMC的遷移、增殖，控制血管壁的不適當(dāng)重塑提供理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 材料與方法： 1、大鼠VSMC的培養(yǎng) 大鼠A10主動(dòng)脈VSMC細(xì)胞株購(gòu)自ATCC細(xì)胞

6、庫(kù)，用含10％胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5％CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用0.25％的胰酶消化、傳代。 2、質(zhì)粒的提純、擴(kuò)增及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 委托TaKaRa公司對(duì)pCMV—Egr—1/NEO、pCMV(—)/NEO質(zhì)粒及pET—28—rOPN/NEO、pET—28(—)/NEO質(zhì)粒進(jìn)行提純、擴(kuò)增及鑒定，其中pET—28—rOPN/NEO和pET—28(—)/NEO

7、質(zhì)粒被連于CMV啟動(dòng)子上，以便在VSMC中表達(dá)。 待培養(yǎng)的VSMCs生長(zhǎng)到80％匯合度時(shí)，以100μg/ml～1mg/ml的新霉素(neomycin418，G418)濃度進(jìn)行最低G418濃度篩選。當(dāng)培養(yǎng)的VSMCs在6孔板內(nèi)達(dá)到80％匯合度時(shí)，應(yīng)用FuGENE6分別向VSMCs內(nèi)轉(zhuǎn)染pCMV—Egr—1/NEO、pCMV(—)/NEO質(zhì)粒及pCMV—ET—28—rOPN/NEO、pCMV—ET—28(—)/NEO質(zhì)粒。細(xì)胞轉(zhuǎn)染2

8、4小時(shí)(hour，h)后，加入400μg/ml G418的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。2周后，采用有限稀釋法將細(xì)胞傳至96孔板中進(jìn)行單克隆化培養(yǎng)(于含200μg/ml G418的條件培養(yǎng)液中)，待長(zhǎng)滿后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并檢測(cè)細(xì)胞中Egr—1、OPNmRNA的表達(dá)。 3、應(yīng)用ERK磷酸化抑制劑阻斷ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路 當(dāng)OPN穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的VSMCs生長(zhǎng)至80％匯合度時(shí)，向細(xì)胞培養(yǎng)液中加入10μMERK磷酸化抑制劑PD98059，繼續(xù)培養(yǎng)24

9、h后，進(jìn)行Western blot檢測(cè)。 4、反轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase polymerase chainreaction，RT-PCR)檢測(cè)Egr—1、OPNmRNA 用Trizol Reagent提取VSMCs的總RNA。用RNA PCR Kit Ver．3.0擴(kuò)增目的片段。PCR產(chǎn)物電泳后，用溴化乙啶(ethidium bromide，EB)染色，BioImaging Syste

10、ms系統(tǒng)成像，用NIH image軟件分析產(chǎn)物條帶灰度，以Egr—1、OPN產(chǎn)物條帶灰度值與甘油醛—3—磷酸脫氫酶(glyceralde—3-Phosphate dehydrogena，GAPDH)產(chǎn)物條帶灰度值的比值分別作為Egr—1、OPNmRNA的相對(duì)表達(dá)量。 5、Western blot檢測(cè)Egr—1、OPN、ERK、P—ERK蛋白 提取細(xì)胞總蛋白，上樣量為80μg。轉(zhuǎn)印到PVDF膜上后用5％脫脂奶粉封閉，用Eg

11、r—1兔抗大鼠多克隆抗體(1：300)、OPN兔抗大鼠多克隆抗體(1：500)、ERK兔抗大鼠多克隆抗體(1：200)、磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(phospho—extracellular signal—regulated kinase，P—ERK)兔抗大鼠多克隆抗體(1：200)及兔抗大鼠α-Tubulin多克隆抗體(1：500)4℃孵育過(guò)夜，分別用相應(yīng)的二抗37℃孵育2h，ECL發(fā)光1分鐘，膠片中的蛋白條帶經(jīng)BioImaging S

12、ystems采集后進(jìn)行灰度值測(cè)定。目的蛋白灰度值與內(nèi)對(duì)照α-Tubulin比值為其相對(duì)蛋白定量。 6、ChIp方法檢測(cè)Egr—1—OPN啟動(dòng)子的結(jié)合 分別取2×106個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Egr—1的VSMCs及正常VSMCs，用甲醛交聯(lián)，0.125M甘氨酸終止交聯(lián)。超聲剪切染色質(zhì)脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)成500～1000個(gè)堿基對(duì)(base pair，bp)片段。分別取50μl全

13、細(xì)胞抽提物作為實(shí)驗(yàn)和陰性對(duì)照樣本。用ChIP緩沖液10倍稀釋后各取其中10μl合并作為輸入對(duì)照(input)，在實(shí)驗(yàn)樣本中加入5g Egr—1兔抗大鼠多克隆抗體(1：300)，將實(shí)驗(yàn)樣品及陰性對(duì)照樣本4℃孵育過(guò)夜。幾次洗滌后，復(fù)合物從珠子上洗脫下來(lái)。用酚氯仿抽提純化DNA，最后應(yīng)用于PCR分析。 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。Egr—1與OPN的相關(guān)性用雙變量相關(guān)分析法(Spearman相關(guān)分

14、析)，不同組間的參數(shù)比較用One—way ANOVA分析，兩兩比較采用LSD方法，p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 1、RT-PCR結(jié)果顯示：Egr—1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組的Egr—1mRNA較正常對(duì)照組和空載體組表達(dá)明顯增強(qiáng)(p<0.01)；OPN穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組OPNmRNA與正常對(duì)照組和空載體組比較，表達(dá)也明顯增強(qiáng)(p<0.01)。 2、RT-PCR及Western blot方法檢測(cè)Egr—1和OPN穩(wěn)定轉(zhuǎn)染VSMC

15、s后OPN和Egr—1的表達(dá)水平。結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組和空載體組比較，Egr—1轉(zhuǎn)染組的OPNmRNA及蛋白表達(dá)均隨著Egr—1表達(dá)的增強(qiáng)而明顯上調(diào)(p<0.01)；同樣，OPN穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組的Egr—1mRNA及蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組和空載體組明顯升高(p<0.01)。 3、ChIP結(jié)果顯示：無(wú)論正常對(duì)照組還是Egr—1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染組的Egr—1抗體免疫沉淀DNA中均可以擴(kuò)增出含OPN啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)的基因調(diào)控區(qū)片段。 4、We

16、stern blot結(jié)果顯示：正常對(duì)照組與OPN轉(zhuǎn)染組給予PD98059后，與未處理組比較，P—ERK/ERK表達(dá)均明顯減少(p<0.01)，同時(shí)，Egr—1表達(dá)明顯下調(diào)(p<0.01)。 結(jié)論： 1、成功建立了Egr—1、OPN的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。 2、Egr—1無(wú)論在轉(zhuǎn)錄水平還是在翻譯水平均可影響OPN的表達(dá)，同樣，OPN也可以影響Egr—1的表達(dá)，二者的表達(dá)呈正相關(guān)性。 3、VSMC中，OPN啟動(dòng)子區(qū)