Egr-1特異誘騙寡核苷酸下調(diào)CCN1抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞遷移.pdf

1、目的:
　　 通過對原代培養(yǎng)的大鼠血管平滑肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染針對早期生長反應(yīng)因子-1(early growth response factor-1,Egr-1)的誘騙寡核苷酸(decoyoligodeoxynucleotide,decoy ODN),檢測轉(zhuǎn)染前后血管平滑肌細(xì)胞(vascular smoothmuscle cell,VSMC)中Egr-1和富含半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich61,CCN1/CYR61)的表達(dá)

2、變化并測量VSMC遷移情況,探討針對Egr-1的decoy ODN對體外培養(yǎng)的大鼠平滑肌細(xì)胞遷移的影響和作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 取大鼠胸主動脈中膜,通過組織塊貼壁法進(jìn)行原代大鼠動脈VSMC培養(yǎng),傳代培養(yǎng)和鑒定,設(shè)計合成針對Egr-1的decoy ODN及誘騙對照寡核苷酸。細(xì)胞爬片后應(yīng)用人工合成的Egr-1 decoy ODN進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。將實驗分為對照組(正常培養(yǎng)細(xì)胞)、誘騙組(Egr-1 decoy ODN轉(zhuǎn)染

3、組)、誘騙對照組(雜碼寡脫氧核苷酸轉(zhuǎn)染組,Egr-1 decoy ODN SCR)。采用RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染前后各組不同時間點(24h、48h、72h)Egr-1及CCN1 mRNA的表達(dá)情況,免疫組織化學(xué)法檢測轉(zhuǎn)染前后各組不同時間點(24h、48h、72h)的Egr-1及CCN1蛋白的表達(dá)變化,進(jìn)行圖像分析,并采用劃痕法測定VSMC的遷移距離。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,計量資料以均值士標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表

4、示,各組間比較應(yīng)用單因素方差分析,P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 成功進(jìn)行原代VSMC培養(yǎng),經(jīng)細(xì)胞鑒定培養(yǎng)細(xì)胞為高純度的VSMC。轉(zhuǎn)染Egr-1decoy ODN及Egr-1 decoy ODN SCR,觀察各組不同時間點Egr-1和CCN1 mRNA及蛋白表達(dá)情況。RT-PCR結(jié)果顯示:Egr-1和CCN1 mRNA在對照組,誘騙組及誘騙對照組中均有表達(dá)。在不同時間點,誘騙組Egr-1和CCN1mRNA

5、的表達(dá)均低于對照組,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析P＜0.05,有統(tǒng)計學(xué)意義。免疫組織化學(xué)法結(jié)果顯示:Egr-1和CCN1蛋白在三組中均有表達(dá)。在不同時間點,誘騙組Egr-1和CCN1蛋白的表達(dá)均低于對照組,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析P＜0.05,有統(tǒng)計學(xué)意義。劃痕實驗結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染后48h,對照組、誘騙組及誘騙對照組VSMC遷移距離分別為105.23±7.81、58.65±12.68、106.47±7.601μm,誘騙組VSMC的遷移距離明顯低于其它兩組(P＜0.0