新型陽離子磷酸膽堿聚合物載反義寡核苷酸抑制血管平滑肌細胞增殖的實驗研究.pdf

1、目的:心血管病基因治療是目前心血管研究領域的熱點,但高效安全的基因載體依然是限制其推廣應用的瓶頸。與病毒類載體相比,非病毒載體在轉染效率,生物相容性和安全性等方面表現(xiàn)出了越來越多的優(yōu)勢。本研究應用新型陽離子磷酸膽堿聚合物(PC polymer)作為非病毒類轉基因載體,通過反義寡核苷酸(AS-ODN)技術抑制血管平滑肌細胞(VSMCs)增殖,以達到通過基因治療手段防治心血管疾病的目的。
　　 方法:
　　 1.應用動態(tài)光散

2、射儀和瓊脂糖凝膠電泳對不同濃度的材料溶液進行表征。
　　 2.將MPC30-DEATo與針對c-myc基因的AS-ODN(c-myc AS-ODN)在不同條件下形成不同N/P比值的基因復合物(N/P=0,0.5,1,3和5:1),應用DNA凝膠電泳法對復合物進行表征。
　　 3.應用MTT法檢測MPC30-DEA70對HEK293細胞和VSMCs的細胞毒性。
　　 4.將MPC30-DEA70/AS-ODN基因復

3、合物轉染至體外培養(yǎng)的HEK293細胞和SD大鼠胸主動脈VSMCs,應用流式細胞術檢測轉染效率和熒光強度。
　　 5.激光共聚焦顯微鏡檢測基因復合物的細胞相容性和細胞內轉運機制。
　　 6.western blot法檢測VSMCs中c-myc蛋白的表達。
　　 7.繪制VSMCs的生長曲線,觀察轉染c-myc AS-ODN后的細胞增殖抑制率。
　　 結果:
　　 1.材料MPC30-DEA70在pH

4、=4.0-11.0范圍內的0.01M PBS溶液中顯示出高度的水溶性,其粒徑分布性和正電呈現(xiàn)pH依賴性,隨pH值降低粒徑分布變窄而正電性增強。
　　 2.N/P=0,0.5,1,3和5:1的MPC30-DEA70/AS-ODN基因復合物在DNA凝膠電泳中顯示出不同程度的電泳遲滯,隨電性增強而顯著。
　　 3.MTT法檢測MPC30-DEA70在對HEK293細胞和VSMCs增殖抑制呈劑量依賴性,隨著MPC30-DEA70

5、濃度的增加,抑制效果明顯,在高濃度時也顯示出一定的細胞毒性。
　　 4.流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn),在HEK293細胞和VSMCs中,復合物的轉染效率和熒光強度隨N/P比值增加而顯著增強,與對照組相比有顯著差異。
　　 5.共聚焦顯微鏡觀察到AS-ODN分子在細胞核內的轉運,提示其有效的核定位。
　　 6.westernblot法檢測到應用MPC30-DEA70轉染c-mycAS-ODN后c-myc蛋白表達的下降。