多沙唑嗪光學(xué)異構(gòu)體抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）增殖是高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化及經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈成形術(shù)（PTCA）后再狹窄等多種疾病的共同病理基礎(chǔ)，抑制VSMCs增殖可能是防止動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成，預(yù)防PTCA術(shù)后再狹窄的有效途徑之一。多沙唑嗪是一種新型長(zhǎng)效且選擇性強(qiáng)的α1腎上腺素能受體阻斷劑，能使周圍血管擴(kuò)張，具有降壓，改善微循環(huán)，改善血脂代謝等作用，并已成為國內(nèi)外治療良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）并發(fā)下

2、尿路癥狀（lower urinary tract symptoms.LUTS）的一線藥物，其不良反應(yīng)少，安全性高。多沙唑嗪經(jīng)手性分離成左旋多沙唑嗪（一）Doxazosin和右旋多沙唑嗪（+）doxazosin。經(jīng)過多年研究結(jié)果表明，（-）Doxazosin可能成為優(yōu)于（+）doxazosin、（±）doxazosin治療BPH/LUTS藥物，但對(duì)于VSMCs的作用尚不清楚。因此，探討（+）Doxazosin及其光學(xué)異構(gòu)體對(duì)大鼠VSMCs

3、增殖的抑制作用十分必要。
　　 方法：選用120～150g健康SD大鼠，采用組織貼塊培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞，胰酶消化法傳代，并應(yīng)用相差顯微鏡和鼠抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白單克隆抗體（Mouse monoclonal anti-smooth muscleα-actin antibody）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)和免疫組化鑒定，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，光學(xué)顯微鏡下觀察經(jīng)（-）Doxazosin、（+）doxazosin和（

4、±）doxazosin處理后VSMCs的形態(tài)學(xué)改變；采用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，觀察（-）Doxazosin、（+）doxazosin和（±）doxazosin的抗大鼠主動(dòng)脈VSMCs的增殖作用以及與α1受體的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 1、VSMC形態(tài)學(xué)觀察及免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定：倒置相差顯微鏡下單個(gè)平滑肌細(xì)胞呈梭形或帶狀，有多個(gè)細(xì)胞突起，胞漿豐富，核卵圓形居中，有一個(gè)或多個(gè)核仁。細(xì)胞生長(zhǎng)致密時(shí)表現(xiàn)為典型的“谷一峰

5、”狀生長(zhǎng)。α-actin免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)顯示，VSMC被染成棕黃色的梭型細(xì)胞，胞漿中沿細(xì)胞縱軸密集排列的束狀肌絲被染成棕黃色。
　　 2、VSMC生長(zhǎng)曲線：VSMC生長(zhǎng)曲線近似“S”形，傳代后第1天細(xì)胞數(shù)有所減少，后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第4天達(dá)到高峰，繼而進(jìn)入平臺(tái)期。
　　 3、（-）Doxazosin、（+）doxazosin和（±）doxazosin對(duì)VSMC增殖的影響：與溶媒組相比，10～30μmol·L-1濃度的（-

6、）Doxazosin和（±）doxazosin作用于VSMCs48h或72h，顯著抑制大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs增殖；而（+）doxazosin僅在30μmol·L-1具有抑制作用。當(dāng)延長(zhǎng)藥物與VSMCs的作用時(shí)間至96 h時(shí)，（-）Doxazosin、（+）doxazosin和（±）doxazosin在3～30μmol·L-1濃度均顯著抑制主動(dòng)脈VSMCs增殖；但是，（-）Doxazosin的抑制作用顯著強(qiáng)于同濃度（+）doxazosin

7、（n=6，P<0.05或0.01），與同濃度（±）doxazosin的抑制作用無顯著差別。不同濃度（-）Doxazosin、（+）doxazosin和（±）doxazosin作用于大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs48h、72h、96h時(shí)，（-）doxazosin、（+）doxazosin和（±）doxazosin對(duì)VSMCs增殖的抑制作用均具有濃度依賴性。以相同濃度的藥物處理大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs48 h、72 h和96h，96h時(shí)三種藥物對(duì)主動(dòng)

8、脈VSMCs增殖的抑制率均高于48h和72h。以不同濃度的藥物處理大鼠胸主動(dòng)脈VSMCs96 h，（+）Doxazosin的IC40值顯著大于（±）doxazosin和（-）doxazosin（n=3，P<0.01）。
　　 4、（±）Doxazosin及其光學(xué)異構(gòu)體的抗VSMCs增殖作用與α1受體的相關(guān)性研究：在酚芐明干預(yù)后，（-）Doxazosin、（+）doxazosin和（±）doxazosin作用于大鼠VSMCs48

9、h，亦均能顯著抑制大鼠VSMCs的增殖。（-）Doxazosin、（+）doxazosin和（±）doxazosin對(duì)VSMCs的抑制率分別為33.24±7.79％、24.12±10.14％和30.60±5.11％。（-）Doxazosin的作用有高于（+）doxazosin的趨勢(shì)，但三種藥物相比，無顯著性差異（P>0.05）。其OD490nm值分別為0.24±0.03、0.27±0.04和0.25±0.02。在分別用溶媒Ⅰ（雙蒸水）、

10、溶媒Ⅱ（乙醇）和酚芐明處理細(xì)胞后，測(cè)得（-）Doxazosin對(duì)細(xì)胞的OD值分別為0.23±0.01、0.24±0.03和0.24±0.03；抑制率分別為33.00±2.79％、32.87±7.20％和33.24±7.79％。三者比較均無顯著性差異；（+）Doxazosin和（±）doxazosin也得到同樣的結(jié)果。
　　 5、（-）Doxazosin、（+）doxazosin和（±）doxazosin對(duì)VSMC細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

11、：VSMCs經(jīng)藥物處理后，可見細(xì)胞形態(tài)改變，呈多角形，與周鄰細(xì)胞脫離，細(xì)胞內(nèi)有細(xì)小顆粒出現(xiàn)，胞壁加厚，輪廓清晰，部分細(xì)胞皺縮呈球形。
　　 結(jié)論：本文首次研究了多沙唑嗪（±）Doxazosin及其光學(xué)異構(gòu)體對(duì)大鼠主動(dòng)脈VSMCs增殖的抑制作用，得出以下結(jié)論：
　　 （±）Doxazosin、（+）doxazosin和（-）doxazosin呈濃度和時(shí)間依賴性的抑制大鼠主動(dòng)脈。VSMCs增殖，并且具有化學(xué)結(jié)構(gòu)的立體選擇性，