ABL SH3-T79Y突變體聯(lián)合伊馬替尼對(duì)CML細(xì)胞增殖和凋亡的影響及機(jī)制研究.pdf

1、慢性粒細(xì)胞白血病的特征性融合蛋白BCR-ABL通過(guò)其SH3結(jié)構(gòu)域與RIN1蛋白高特異性低親合力結(jié)合，導(dǎo)致酪氨酸激酶活性持續(xù)活化，促進(jìn)疾病發(fā)生發(fā)展。課題組前期通過(guò)計(jì)算機(jī)藥物設(shè)計(jì)技術(shù)獲得ABLSH3突變體SH3-T79Y，通過(guò)其與RIN1蛋白相互作用并聯(lián)合伊馬替尼（Imatinib，IM），可在體外有效抑制慢粒細(xì)胞株K562及KCL22細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡。
　　本課題擬檢測(cè) SH3-T79Y聯(lián)合IM作用于慢粒耐藥細(xì)胞株K562/G01

2、引起的增殖、凋亡效應(yīng)改變，并分析其發(fā)生作用的機(jī)制；構(gòu)建小鼠皮下瘤和血液瘤模型，進(jìn)一步探討SH3-T79Y聯(lián)合IM對(duì)KCL22細(xì)胞在動(dòng)物體內(nèi)的增殖能力和致病性的影響。采用的實(shí)驗(yàn)方法如下：
　　1.Western Blot檢測(cè)不同濃度的IM對(duì)K562/G01細(xì)胞p-BCR-ABL蛋白的影響，篩選聯(lián)合用藥的IM濃度；SH3-T79Y與IM聯(lián)合處理細(xì)胞后，采用克隆形成實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分析細(xì)胞增殖，瑞氏染色觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、流

3、式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率分析細(xì)胞凋亡效應(yīng)。
　　2.SH3-T79Y聯(lián)合IM用藥處理K562/G01細(xì)胞后，Western Blot檢測(cè)p-BCR-ABL/BCR-ABL、p-CrkL/CrkL、p-Stat5/Stat5、p-Akt/Akt、MEK、p-Erk/Erk、Bcl-2、Bax、c-Myc、Cyclin-D1、Caspase-8、BID和 Caspase-3蛋白表達(dá)水平的變化，分析聯(lián)合用藥作用機(jī)制。
　　3.SH3

4、-T79Y聯(lián)合 IM處理 KCL22細(xì)胞后，經(jīng)皮下注射于Balb/c裸鼠構(gòu)建皮下實(shí)體瘤模型，經(jīng)尾靜脈注射于NOD-SCID小鼠構(gòu)建慢性粒細(xì)胞白血病移植瘤模型，以IM單獨(dú)處理和經(jīng)PBS處理的KCL22細(xì)胞為對(duì)照組。通過(guò)比較小鼠一般情況，計(jì)算皮下瘤成瘤率，瑞氏染色監(jiān)測(cè)血液瘤模型鼠骨髓和外周血象變化，HE染色觀(guān)察肝、脾組織腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)情況，PCR檢測(cè)其骨髓細(xì)胞bcr-abl基因表達(dá)水平，繪制生存曲線(xiàn)，探討聯(lián)合用藥對(duì)KCL22細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)

5、增殖能力和致病性的影響。
　　通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)，獲得如下結(jié)果和結(jié)論：
　　1.K562/G01細(xì)胞對(duì)IM耐藥，聯(lián)合用藥IM濃度選擇為3μM。SH3-T79Y聯(lián)合IM作用使K562/G01細(xì)胞克隆形成率明顯降低，細(xì)胞周期阻滯在S期；瑞氏染色見(jiàn)凋亡小體、核聚集、核碎裂等典型凋亡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡率顯著增加。
　　結(jié)果證實(shí)：SH3-T79Y聯(lián)合IM可在體外有效抑制K562/G01細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡。
　　2 SH3-T79Y聯(lián)

6、合IM可明顯抑制K562/G01細(xì)胞BCR-ABL、CrkL磷酸化水平；抑制下游信號(hào)通路p-Stat5/Stat5、p-Akt、MEK、p-Erk/Erk蛋白表達(dá)；抑制凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2、c-Myc，增加 Bax；抑制周期蛋白Cyclin-D1；同時(shí)可促進(jìn)Caspase-8、Caspase-3活化，對(duì)BID沒(méi)有明顯影響。
　　結(jié)果證實(shí)：SH3-T79Y聯(lián)合IM用藥影響K562/G01細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制與調(diào)節(jié)BCR-ABL底

7、物水平、影響下游信號(hào)通路相關(guān)蛋白及凋亡相關(guān)蛋白等有關(guān)。
　　3.Balb/c裸鼠皮下瘤模型中PBS對(duì)照組、IM單獨(dú)處理組、聯(lián)合用藥組成瘤率分別為100％、33.3%、16.7%。NOD-SCID小鼠CML移植瘤模型中，PBS對(duì)照組于注射細(xì)胞后約4周開(kāi)始逐漸出現(xiàn)反應(yīng)力下降、精神萎靡、股骨肌腫大、后肢骨節(jié)出血點(diǎn)等體征，外周血白細(xì)胞從第5周逐漸增多，計(jì)數(shù)顯著升高，血涂片可見(jiàn)幼稚粒細(xì)胞，肝、脾組織切片及骨髓涂片可見(jiàn)白血病細(xì)胞浸潤(rùn)，骨髓細(xì)胞