負(fù)載eNOS-F92A-Cav1基因的BMSCs調(diào)節(jié)KLF4治療大鼠肺動脈高壓的機制.pdf

1、本文從以下兩部分展開論述：
　　第一部分 eNOS/F92A-Cav1基因?qū)MSCs細(xì)胞中NO含量及血管形成能力的影響
　　目的：本課題采用內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）與突變的小窩蛋白（F92A-Cav1）基因共感染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC），研究eNOS/F92A-Cav1基因?qū)MSCs擴(kuò)血管因子NO的產(chǎn)生及BMSCs的血管形成能力的影響，以期改善肺動脈高壓（PAH）的血管功能。
　　方法：本研究中采用Fic

2、oll（1.077g/ml）密度梯度離心法從大鼠股骨及脛骨骨髓中提取并培養(yǎng)BMSCs，使用流式細(xì)胞儀技術(shù)對BMSCs進(jìn)行表型鑒定；按Lipofectamin2000轉(zhuǎn)染試劑說明將各目的基因及包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并濃縮、純化慢病毒顆粒；將指數(shù)生長期的BMSCs隨機分為6組：空白對照組（僅BMSCs）、陰性對照組（感染空載體pLVX-mCMV-ZsGreen的慢病毒質(zhì)粒）、Cav1組（感染LV-Cav1慢病毒顆粒），F(xiàn)92A-Cav1

3、組（感染LV-F92A-Cav1慢病毒顆粒）、eNOS組（感染LV-eNOS的慢病毒顆粒）、及eNOS/F92A-Cav1組（共感染LV-eNOS和LV-F92A-Cav1慢病毒顆粒）；病毒感染5天后，westong-blot法觀察各組eNOS及Cav1蛋白的表達(dá)；以griess法檢測細(xì)胞上清液培養(yǎng)基中NO的含量；采用cck-8法觀察生成的NO是否影響B(tài)MSCs細(xì)胞活性；血管形成實驗觀察各組BMSCs的血管形成能力。
　　結(jié)果：濃

4、縮純化的慢病毒滴度為1×108TU/ml；倒置熒光顯微鏡下觀察各組慢病毒感染BMSCs的效率達(dá)85％以上；weston-blot檢測結(jié)果顯示，eNOS及eNOS/F92A-Cav1組中eNOS蛋白表達(dá)明顯增高，Cav1、F92A-Cav1及eNOS/F92A-Cav1組Cav1蛋白的表達(dá)增高；與對照組相比，NO的終末穩(wěn)定產(chǎn)物Nitrite的含量以eNOS/F92A-Cav1組最高（p<0.01），同時發(fā)現(xiàn)作為氮自由基的NO的增高，并不影

5、響各組BMSCs細(xì)胞的活性（p>0.05）；血管形成實驗發(fā)現(xiàn)eNOS/F92A-Cav1組BMSCs的血管形成能力最強。
　　結(jié)論：各組慢病毒顆粒可高效感染BMSCs，感染效率達(dá)85%以上；共感染LV-eNOS和LV-F92A-Cav1慢病毒的BMSCs組中的NO含量最高，血管形成能力也較強，但升高的NO對BMSCs細(xì)胞活性并無明顯殺傷作用，該研究為未來基于基因轉(zhuǎn)染的BMSCs細(xì)胞治療肺動脈高壓等相關(guān)疾病奠定基礎(chǔ)。
　　第二

6、部分 體內(nèi)實驗研究eNOS/F92A-Cav1基因修飾的BMSCs降低大鼠肺動脈壓力的機制
　　目的：本研究旨在探索eNOS/F92A-Cav1修飾后的BMSCs降低大鼠肺動脈壓力的具體分子機制，為未來基于基因修飾的BMSCs治療PAH的研究奠定科學(xué)的理論基礎(chǔ)。
　　方法：首先，采用野百合堿建立Wistar大鼠肺動脈高壓模型；其次，PAH建立兩周后，生理記錄儀檢測并記錄大鼠肺動脈壓力曲線，計算平均肺動脈壓（MPAP），對大鼠

7、右心室（RV）和左心室（LV）及室間隔（S）進(jìn)行稱重，計算右心肥厚指數(shù)（RV/（LV+S）；以蘇木精-伊紅法（HE）染色玻片，測量肺小動脈中膜的厚度（MT）、血管外徑（ED），計算出肺小動脈管腔面積（VA）、血管總面積（TAA）、MT/ED（MT%）及VA/TAA（VA%）的值；再次，根據(jù)體內(nèi)試驗結(jié)果，將實驗動物隨機分為5組：即正常對照組（正常大鼠）、PAH組（靜脈注射生理鹽水治療）、陰性對照組（注射空載體感染的BMSCs治療）、eNO

8、S組（注射LV-eNOS感染的BMSCs治療），eNOS/F92A-Cav1組（注射LV-eNOS和LV-F92A-Cav1共感染的BMSCs治療），實驗動物建模2W后，以尾靜脈注射法，將2×106/ml感染各組慢病毒的BMSCs細(xì)胞移植入相應(yīng)實驗動物組體內(nèi)，2w時間為一療程，治療2個療程，2個療程后觀察大鼠存活等一般情況；最后，于治療4周后生理記錄儀檢測并記錄大鼠肺動脈壓力曲線，計算平均肺動脈壓（MPAP），對大鼠右心室（RV）和左心

9、室（LV）及室間隔（S）的進(jìn)行稱重，計算右心肥厚指數(shù)（RV/（LV+S）；以蘇木精-伊紅法（HE）染色玻片，測量肺小動脈中膜的厚度（MT）、血管外徑（ED），計算出肺小動脈管腔面積（VA）、血管總面積（TAA）、MT/ED（MT%）及VA/TAA（VA%）的值；以griess法檢測細(xì)胞上清液中NO的含量；以PCR法觀察各組大鼠肺組織eNOS、PGIS、ET、KLF4mRNA的表達(dá)水平；western-blot法觀察eNOS蛋白的表達(dá)情況

10、。
　　結(jié)果：與PAH大鼠模型組相比，給予負(fù)載eNOS/F92A-Cav1的BMSCs細(xì)胞可有效降低 PAH大鼠肺動脈壓力（p<0.01）；抑制肺小血管平滑肌細(xì)胞的增生；降低右心肥厚指數(shù)RV/（LV+S）（p<0.01）和肺動脈中膜厚度指數(shù)（MT%）（p<0.01），血管管腔面積指數(shù)（VA%）（p<0.01）增高；血清中亞硝酸鹽含量檢測發(fā)現(xiàn)eNOS/F92A-Cav1組最高（p<0.01）；Realtime-PCR及western

11、-blot研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，移植BMSCs細(xì)胞的各組大鼠肺組織中eNOS蛋白及mRNA的表達(dá)水平增高，縮血管因子ET1 mRNA的表達(dá)水平（p<0.01）均降低，而擴(kuò)血管因子PGIS mRNA的表達(dá)水平（p<0.01）升高，同時轉(zhuǎn)錄因子KLF4 mRNA的表達(dá)水平增高，其中以eNOS/F92A-Cav1組表現(xiàn)最為明顯（p<0.01，p<0.01）。
　　結(jié)論：本課題成功構(gòu)建PAH的動物模型，獲得科學(xué)的體內(nèi)試驗研究體系；研究證明負(fù)載eN