荊芥、柴胡種質(zhì)鑒定技術(shù)研究.pdf

1、荊芥(Schizonepetae Herba)和柴胡（Bupleuri Radix）作為常用大宗中藥材，其藥用歷史悠久，社會(huì)需求量大。藥材種質(zhì)質(zhì)量的優(yōu)劣和安全性會(huì)直接影響中藥系列產(chǎn)品的質(zhì)量和臨床療效。荊芥和柴胡生產(chǎn)所用的種質(zhì)以往主要從野生種馴化而來(lái)，并逐步通過(guò)自種自繁形成了各個(gè)地區(qū)的地方種質(zhì)。但在，長(zhǎng)期的種植過(guò)程中，只種不選和引種不科學(xué)等問(wèn)題造成了種質(zhì)混雜、退化，影響了藥材的質(zhì)量和產(chǎn)量。在部分地區(qū)還存在地方習(xí)用品和混偽品，也影響了用藥安

2、全和臨床療效。近年來(lái)，隨著人工育種在藥用植物領(lǐng)域的興起，出現(xiàn)了一批具有優(yōu)良性狀的中藥材新種質(zhì)，為中藥材的產(chǎn)量和質(zhì)量提供了有效的保證。隨著市場(chǎng)上流通的種質(zhì)數(shù)目不斷增加，探索準(zhǔn)確、有效、快速的種質(zhì)鑒定方法成為維護(hù)藥農(nóng)、育種學(xué)家和藥企權(quán)益，穩(wěn)定藥材市場(chǎng)秩序的當(dāng)務(wù)之急。由于傳統(tǒng)的鑒定方法已無(wú)法滿足現(xiàn)今種質(zhì)鑒定的需求，本研究擬利用分子和化學(xué)方法對(duì)荊芥、柴胡種質(zhì)進(jìn)行鑒定，以促進(jìn)其種質(zhì)的選育、開(kāi)發(fā)與利用。
　　本研究利用分子和化學(xué)方法，鑒定了中

3、國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所魏建和課題組選育的裂葉荊芥(Schizonepeta tenuifolia(Benth.) Briq.）“中荊”系列新品種和柴胡（Bupleurum chinense DC.）“中柴”系列新品種以及目前市場(chǎng)上主要流通的荊芥、柴胡種質(zhì)，建立了荊芥和柴胡種質(zhì)鑒定體系。主要研究結(jié)果如下:
　　1、建立了裂葉荊芥ITS2條形碼鑒定體系，可以對(duì)裂葉荊芥及其混偽品進(jìn)行穩(wěn)定、準(zhǔn)確的鑒別。以12種裂葉荊芥種質(zhì)為實(shí)驗(yàn)樣本，

4、按照中藥材DNA條形碼分子鑒定標(biāo)準(zhǔn)操作流程提取ITS2序列。結(jié)果顯示，裂葉荊芥ITS2序列長(zhǎng)度為232 bp。不同來(lái)源裂葉荊芥ITS2序列一致，其與8個(gè)混偽品物種之間序列差異明顯，遠(yuǎn)大于種內(nèi)差異。將裂葉荊芥與同屬唇形科植物的混偽品構(gòu)建NJ樹(shù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，顯示裂葉荊芥與近緣物種及其混偽品分支明顯。
　　2、建立了藥用植物荊芥最佳SRAP-PCR反應(yīng)體系，為進(jìn)一步的分子鑒定研究建立基礎(chǔ)。通過(guò)單因素和正交設(shè)計(jì)兩種實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)PCR反

5、應(yīng)體系中的Mg2+，dNTP，引物，Taq聚合酶和DNA模板進(jìn)行條件摸索。最終確定得到荊芥25μL優(yōu)化反應(yīng)體系為:2.00 mmol/LMg2+、0.20 mmol/L dNTPs、1.5U Taq聚合酶、0.50μmol/L引物、20 ng DNA模板和2.5μL10×Ex Taq Buffer;各因素對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果的影響從大到小依次是:Mg2+、DNA模板、Taq聚合酶、dNTPs、引物。運(yùn)用該優(yōu)化體系從264對(duì)引物中篩選出能擴(kuò)增出

6、清晰條帶的14對(duì)。該結(jié)果可以為后續(xù)利用SRAP進(jìn)行種質(zhì)鑒定實(shí)驗(yàn)提供參考。
　　3、建立了裂葉荊芥SRAP分子標(biāo)記鑒定體系，對(duì)荊芥新品種和主要品種進(jìn)行鑒定，初步探究了不同來(lái)源荊芥種質(zhì)遺傳關(guān)系。應(yīng)用14對(duì)引物組合對(duì)12個(gè)荊芥種質(zhì)共132個(gè)樣品進(jìn)行SRAP分子標(biāo)記鑒定。電泳結(jié)果顯示，共擴(kuò)增出261個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶有234個(gè)，多態(tài)性百分率89.66％。12個(gè)荊芥種質(zhì)多態(tài)性條帶百分率從29.12％到83.14％，說(shuō)明不同種質(zhì)內(nèi)部分化程

7、度差異明顯，新品種整齊度高于地方生產(chǎn)種質(zhì)。通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，4個(gè)種質(zhì)（中荊1號(hào)、中荊2號(hào)、安國(guó)荊芥、玉田荊芥）在4個(gè)引物組合(Me1/Em13，Me1/Em17，Me3/Em18，Me7/Em13)擴(kuò)增下，能夠分別產(chǎn)生特異性條帶，與其它種質(zhì)區(qū)分開(kāi)來(lái)。聚類(lèi)分析和主成分分析顯示，不同荊芥種質(zhì)相似性與遺傳關(guān)系相關(guān)而與地理位置無(wú)關(guān)。該結(jié)果可為荊芥種質(zhì)的鑒定、生產(chǎn)、利用和遺傳多樣性研究提供了參考。
　　4、建立了不同來(lái)源荊芥藥材的GC特征圖譜，

8、為荊芥藥材的品種鑒定和質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。通過(guò)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，最終確定揮發(fā)油提取方法為:料液比10∶1，浸泡時(shí)間2h，提取時(shí)間3h。使用GC-FID方法測(cè)定了40批荊芥樣品揮發(fā)油，運(yùn)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004版》軟件建立了荊芥藥材特征圖譜，并進(jìn)行了相似度評(píng)價(jià)、聚類(lèi)分析和主成分分析。結(jié)果顯示40批荊芥樣品的GC特征圖譜共有10個(gè)共有峰，通過(guò)聚類(lèi)分析和主成分分析，可以將40批不同來(lái)源荊芥很好的歸為4類(lèi)。
　　5、建立了

9、柴胡栽培種質(zhì)SSR分子標(biāo)記鑒定體系，為鑒別柴胡新品種和選育品系提供了依據(jù)。從50對(duì)柴胡SSR引物序列中選擇了9對(duì)多態(tài)性高、條帶清晰的引物，對(duì)2個(gè)選育品系和4份其它柴胡栽培種質(zhì)材料進(jìn)行擴(kuò)增。通過(guò)特異的SSR條帶，可以將不同柴胡種質(zhì)進(jìn)行鑒定區(qū)分。并依據(jù)遺傳距離構(gòu)建聚類(lèi)樹(shù)狀圖，將所有樣品分為四類(lèi):黑龍江產(chǎn)狹葉柴胡和川紅柴1號(hào)品系聚為一類(lèi)，川北柴1號(hào)品系和中柴1號(hào)品種聚為一類(lèi)，四川楓順和榮縣產(chǎn)柴胡種質(zhì)各獨(dú)自聚為一類(lèi)。該研究可以用于柴胡種質(zhì)鑒定，