重組CC16蛋白質(zhì)對(duì)COPD炎癥作用的研究.pdf

1、目的：
　　1.重組蛋白CC16的誘導(dǎo)表達(dá)和純化。
　　2.觀察 rCC16蛋白質(zhì)對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)表達(dá)的抑制作用。
　　3.研究重組 CC16蛋白質(zhì)對(duì) COPD小鼠模型肺部炎癥反應(yīng)的作用及其對(duì)支氣管灌洗液中與血清IL-6、TNF-a、IL-8、IL-1β表達(dá)的影響。
　　4.研究重組 CC16蛋白質(zhì)對(duì) COPD模型組肺組織氣道上皮中 CC16、NF-κB、MMP-9、TIMP-1、ICAM

2、-1表達(dá)的影響。
　　方法：
　　1.將成功構(gòu)建的 pET-30a（+）-rCC16重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞 BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，Ni+-NTA樹(shù)脂親和純化，Western blotting檢測(cè)分析純化的重組CC16蛋白。去內(nèi)毒素后得到實(shí)驗(yàn)用的重組rCC16蛋白質(zhì)。
　　2.通過(guò)檢測(cè) PLA2的活性，從而判斷 rCC16蛋白質(zhì)是否具有生物活性。將不同濃度（0、0.5、1、2.5μg/mL）的重組CC16作用于

3、小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7），共同培養(yǎng)1、2、3、4、5天，通過(guò) CCK-8檢測(cè) RAW264.7細(xì)胞的增殖，明確重組rCC16對(duì)RAW264.7細(xì)胞的毒理作用。
　　3.不同濃度重組CC16（0、0.5、1、2.5μg/mL）預(yù)干預(yù)RAW264.7細(xì)胞2小時(shí)后，LPS（0.1μg/mL）刺激RAW264.7細(xì)胞，24小時(shí)后收集上清，采用ELISA試劑盒測(cè)定IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α的蛋白水平。
　　4.

4、采用被動(dòng)吸入香煙煙霧結(jié)合鼻腔滴入 LPS法復(fù)制小鼠 COPD模型，實(shí)驗(yàn)組小鼠給予不同濃度重組rCC16蛋白質(zhì)（1、2.5μg/mL體重rCC16，即低劑量組與高劑量組）進(jìn)行滴鼻干預(yù)，1月后行HE染色觀察rCC16干預(yù)組小鼠肺組織的病理變化，進(jìn)而檢測(cè)重組rCC16對(duì)COPD是否有干預(yù)作用。收集COPD小鼠和rCC16干預(yù)組小鼠 BALF和血清，ELISA方法檢測(cè) TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β的表達(dá)，明確重組CC16對(duì)COPD

5、小鼠炎性介質(zhì)表達(dá)的干預(yù)作用。
　　5.取 COPD小鼠和rCC16干預(yù)組小鼠的肺組織切片，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)CC16、NF-κB、MMP-9、ICAM-1、TIMP-1的表達(dá)，進(jìn)一步明確重組 CC16對(duì)COPD小鼠的的干預(yù)作用及可能的機(jī)制。
　　結(jié)果：
　　1.SDS-PAGE結(jié)果顯示，獲得純度高于95％的重組rCC16蛋白質(zhì)；Western blotting結(jié)果表明，rCC16可被抗CC16抗體特異性的識(shí)別。

6、　　2.(1)0.5μg/mL rCC16可抑制PLA2的活性，且隨著rCC16劑量的增加（1.0、2.0μg/mL），抑制作用越明顯。提示獲得的rCC16具有生物活性。
　　(2)5μg/mL以下劑量rCC16對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖及活力無(wú)明顯影響。5μg/mL劑量組細(xì)胞的吸光度值明顯降低，提示該劑量的 rCC16對(duì) RAW264.7細(xì)胞的增殖有抑制作用。
　　3.不同濃度重組CC16（0、0.5、1、2.5μg/mL

7、）干預(yù)RAW264.7細(xì)胞2小時(shí)后LPS（0.1μg/mL）刺激RAW264.7細(xì)胞24小時(shí)，收集上清，ELISA檢測(cè)結(jié)果：
　　(1)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞上層培養(yǎng)液，檢測(cè)TNF-α含量：LPS組相比照組明顯升高（對(duì)照組:85.76±13.41 ng/L，LPS組:443.77±20.70 ng/L）（P<0.01）。預(yù)先給予不同濃度的重組rCC16干預(yù)后，檢測(cè)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞24 h后

8、上清液中TNF-α含量：與LPS組相比，rCC16（1.0μg/mL、2.0μg/mL）組明顯降低（1.0μg/mL組：372.73±25.38 ng/L，2.0μg/mL組：357.02±24.84 ng/L）（P<0.01），且隨著rCC16劑量的增加TNF-α含量減少的越明顯。
　　(2)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞上清液，檢測(cè)IL-8含量：LPS組相比對(duì)照組明顯升高（對(duì)照組23.55±8.55 pg/

9、mL，LPS組82.66±9.76 pg/mL）（P<0.01）。預(yù)先給予不同濃度的重組 rCC16干預(yù)后，檢測(cè) LPS刺激 RAW264.7細(xì)胞24h后上清液中IL-8含量，與LPS組相比，2.0μg/mL rCC16干預(yù)組IL-8表達(dá)下降（60.30±8.09 pg/mL）（P<0.05），其余兩組則沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.5μg/mL組：76.34±8.34 pg/mL，1.0μg/mL組：69.03±10.45 pg/mL）（P>0

10、.05）。
　　(3)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞上清液，檢測(cè)IL-6含量：LPS組相比對(duì)照組明顯升高（對(duì)照組21.02±6.00 pg/mL，LPS組128.96±5.94 pg/mL）（P<0.01）。預(yù)先給予不同濃度的重組rCC16干預(yù)后，檢測(cè)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞24 h后上清液中IL-6含量：與LPS組相比，各劑量組均可以降低LPS誘導(dǎo)的IL-6的表達(dá)，（0.5μg/mL組：111.27±6

11、.37 pg/mL，P<0.05；1.0μg/mL組：95.22±10.63 pg/mL，P<0.01；2.0μg/mL組：57.38±14.26 pg/mL，P<0.01）。
　　(4)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞上清液，檢測(cè)不同劑量rCC16對(duì)IL-1β的影響，結(jié)果顯示，各劑量組均無(wú)對(duì) IL-1β的表達(dá)無(wú)作用（對(duì)照組：17.46±1.09 ng/L，LPS組：21.08±4.16 ng/L，0.5μg/m

12、L組：16.44±1.73 ng/L，1.0μg/mL組：16.33±1.41 ng/L，2.0μg/mL組：15.36±1.79 ng/L，P值均大于0.05）。
　　4.采用被動(dòng)吸煙聯(lián)合鼻腔滴入 LPS法復(fù)制小鼠 COPD模型，同時(shí)給予不同濃度重組rCC16（1、2.5μg/g體重rCC16，即低劑量組與高劑量組）進(jìn)行滴鼻干預(yù)，未干預(yù)組和PBS滴鼻組作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照。
　　(1) HE染色結(jié)果顯示：COPD小鼠模型組其肺泡的

13、完整結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的破壞，進(jìn)而聚集融合形成了較大的肺大泡，氣道黏膜褶皺增多，纖毛脫落，官腔變窄。應(yīng)用重組 rCC16蛋白質(zhì)干預(yù)后，上述癥狀有所改善。肺大泡的形成較 COPD組明顯減少，官腔逐漸恢復(fù)正常形態(tài)，且高劑量組較低劑量組的作用明顯。
　　(2)收集肺泡灌洗液和血清， ELISA方法檢測(cè) TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β的表達(dá)。結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比較，COPD組模型組血清和灌洗液中的 TNF-α含量明顯升高（正常

14、組血清：61.12±13.37 ng/L，正常組灌洗液：67.57±18.03 ng/L， COPD組血清：116.04±12.10 ng/L，COPD組灌洗液：138.69±19.74 ng/L）（P<0.05）。給予不同濃度的重組rCC16干預(yù)后，高劑量組血清中的TNF-α與COPD組相比較含量明顯減少（高劑量組血清：66.37±18.50 ng/L）（P<0.01）；灌洗液中TNF-α的含量與 COPD組相比較含量明顯減少（灌洗液

15、低劑量組：109.05±10.94 ng/L，灌洗液高劑量組：97.55±17.76 ng/L）（P<0.01），且隨著rCC16濃度的增加， TNF-α含量減少；與正常對(duì)照組相比較，COPD組血清和灌洗液中的 IL-6含量明顯增多（正常組血清：69.12±5.21 pg/mL，正常組灌洗液：20.70±5.23 pg/mL，COPD組血清：179.90±9.46 pg/mL，COPD組灌洗液：69.04±9.64 pg/mL）（P<0

16、.01）。給予不同濃度的重組rCC16干預(yù)后，結(jié)果顯示，灌洗液中和血清中的IL-6與COPD組相比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（灌洗液低劑量組：51.28±11.94 pg/mL，灌洗液高劑量組：43.04±8.63 pg/mL：血清低劑量組：146.80±8.58 pg/mL，血清高劑量組：106.64±5.26 pg/mL）（P<0.05），且隨著rCC16濃度的增加，IL-6含量減少；與正常對(duì)照組相比較 COPD組血清和灌洗液中的 IL-8含

17、量明顯升高（正常組血清：96.35±9.70 pg/mL，正常組灌洗液：63.54±7.69 pg/mL，COPD組血清：157.60±19.31 pg/mL，COPD組灌洗液：133.25±7.29 pg/mL）（P<0.01）。給予不同濃度的重組rCC16干預(yù)后，灌洗液中 IL-8與 COPD組相比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（灌洗液低劑量組：89.24±9.25 pg/mL，灌洗液高劑量組：62.07±6.75 pg/mL）（P<0.01），

18、且隨著rCC16濃度的增加，IL-8含量減少。血清中 IL-8與 COPD組相比,高劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（血清高劑量組：113.73±5.75 pg/mL）；與正常對(duì)照組相比較COPD組血清中的IL-1β含量明顯升高（正常組血清：91.02±9.82 pg/mL，COPD組血清：118.49±15.18 pg/mL）（P<0.01）。給予不同濃度的重組rCC16干預(yù)后，灌洗液中和血清中的IL-1β與COPD組相比較均沒(méi)有意義（血清低劑量組

19、：116.96±8.42 ng/L，血清高劑量組；109.90±6.79 ng/L灌洗液低劑量組：127.99±18.47 ng/L灌洗液高劑量組：118.15±10.96 ng/L）（P>0.05）。
　　5.免疫組化：小鼠肺組織氣道上皮中 CC16、MMP-9、TIMP-1、ICAM-1的表達(dá)水平用灰度值表示，灰度值越大，表達(dá)水平越低。小鼠肺組織氣道上皮中 NF-κB p65的表達(dá)用入核陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)所得的百分比表示，百

20、分比越大，入核表達(dá)越強(qiáng)。
　　COPD組的小鼠肺組織氣道上皮中的 CC16的含量較正常組明顯減少（正常組平均灰度值為178.61±1.58，COPD組平均灰度值為196.05±2.30）（P<0.05）。而COPD組中的 MMP-9、TIMP-1、ICAM-1的表達(dá)較正常組均高。差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（正常組 MMP-9平均灰度值：201.08±3.03，COPD組 MMP-9平均灰度值：148.17±2.12；正常組TIMP-1平

21、均灰度值：206.09±1.93，COPD組TIMP-1平均灰度值：176.27±1.79；正常組 ICAM-1平均灰度值：193.67±2.88，COPD組 ICAM-1平均灰度值：176.35±1.94）（P<0.05）。隨著 rCC16的干預(yù)，高劑量組干預(yù)組肺組織中的CC16的含量有所增加（高劑量組平均灰度值：181.59±3.12，P<0.01）， MMP-9的表達(dá)隨著 rCC16濃度的增加而下降，呈現(xiàn)一定的劑量依賴(lài)關(guān)系（低劑量

22、組：164.93±1.92，高劑量組：178.77±2.38， P<0.05）；TIMP-1、ICAM-1的表達(dá)隨著rCC16的干預(yù)較 COPD組有所減少，但高劑量組與低劑量組沒(méi)有差異（低劑量TIMP-1組：197.43±2.04，高劑量 TIMP-1組：195.03±2.21；低劑量 ICAM-1組：190.82±3.87，高劑量ICAM-1組：186.69±3.12，P>0.05）。與正常相比較，COPD組小鼠肺組織氣道上皮中NF-

23、κB p65發(fā)生了核轉(zhuǎn)移，入核明顯增多(正常組：20.32±1.98，COPD組：48.02±4.70，P<0.05)，隨著rCC16的干預(yù)，干預(yù)組肺組織細(xì)胞核中的NF-κB p65含量減少，且有一定的劑量依賴(lài)關(guān)系，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（低劑量組：38.92±3.27；高劑量組：31.79±2.02，P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.純化的重組rCC16蛋白質(zhì)具有生物活性，5μg/mL的濃度以下對(duì)細(xì)胞的活力沒(méi)有明顯的影響。

24、
　　2. rCC16可以抑制由LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌的細(xì)胞炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6，高劑量下對(duì)IL-8有抑制作用，但對(duì)于IL-1β則沒(méi)有明顯的作用。
　　3.(1) rCC16治療組與COPD組相比肺大泡的形成，氣道黏膜褶皺增多，纖毛脫落，管腔變窄等問(wèn)題均有所改善，且高劑量較低劑量的作用明顯。
　　(2) rCC16可以抑制肺泡灌洗液和血清中的TNF-α、IL-6及灌洗液中IL-8的表達(dá)，高