BODIPY類熒光試劑測定巰基化合物的研究.pdf

1、巰基(-SH)是細(xì)胞中化學(xué)活性最高的基團(tuán)。巰基化合物在調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原平衡、保護(hù)生物膜系統(tǒng)、抗氧化應(yīng)激和抗氧化損傷等方面具有非常重要的作用。研究表明,生物體中巰基化合物含量的異常也與許多疾病有關(guān)。此外，小分子硫醇化合物是重要的工業(yè)生產(chǎn)原料,可能引起環(huán)境污染問題。隨著巰基化合物在生物體系和環(huán)境中的重要影響被逐漸認(rèn)識,鑒別和定量測定巰基化合物日益受到關(guān)注。因此發(fā)展高靈敏、易操作、快速的巰基化合物分析方法具有十分重要的意義。
　　由于小

2、分子巰基化合物一般不發(fā)光也不具備生色團(tuán)，所以需采用化學(xué)衍生技術(shù)進(jìn)行衍生，生成有強(qiáng)熒光的物質(zhì)，以達(dá)到高靈敏度檢測的目的。本文利用熒光探針與巰基化合物衍生后，再分別采用毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測法（CE-LIF）和高效液相色譜-熒光檢測法（HPLC-FL）分析測定生物樣品和環(huán)境樣品中的巰基化合物，并對細(xì)胞中的巰基化合物進(jìn)行熒光成像分析。主要研究內(nèi)容如下：
　?。?）建立了以N-（4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-3a,4a-二雜

3、氮-s-葵烷-2-甲基）碘乙酰胺（BODIPY?507/545 IA）為柱前衍生試劑，高效液相色譜-熒光檢測和毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測法測定半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽三種物質(zhì)的方法。研究表明，使用HPLC-FL測定半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽，三種分析物在20 min內(nèi)達(dá)到基線分離，檢出限（S/N=3）分別為5、10和5 nmol/L；用CE-LIF測定半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽，三種分析物在9 min內(nèi)達(dá)到基線分離，檢出

4、限（S/N=3）為0.5 nmol/L。相關(guān)系數(shù)在0.9967-0.9991之間，線性關(guān)系良好。采用HPLC-FL和CE-LIF兩種方法檢測血漿和尿液樣品的加標(biāo)回收率分別在93.8-108.1％和93.5-107.2%之間。
　?。?）建立了以1,3,5,7-四甲基-8-溴甲基-二氟化硼-二吡咯甲烷（TMMB-Br）為柱前衍生試劑，高效液相色譜法測定巰基乙醇、丙硫醇和丁硫醇三種小分子巰基化合物的方法。詳細(xì)優(yōu)化了分離條件和衍生條件。

5、三種巰基化合物在45℃下，15 min即可完成衍生反應(yīng)。巰基乙醇、丙硫醇、丁硫醇的檢出限（S/N=3）分別為5、10和10 nmol/L。分析物的峰面積和遷移時(shí)間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）的范圍分別在0.39-2.31%和0.19-0.83%之間。成功應(yīng)用于水樣中巰基化合物的測定，加標(biāo)回收率在95.9-105.7%之間。該方法具有靈敏度高、操作簡單、重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。
　?。?）以N-（4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-3a,4a

6、-雜氮-s-葵烷-2-甲基）碘乙酰胺（BODIPY?507/545 IA）為衍生試劑，在模擬生物環(huán)境中,研究了BODIPY?507/545 IA對細(xì)胞破碎液中半胱氨酸的響應(yīng)。探針與半胱氨酸響應(yīng)的熒光強(qiáng)度與半胱氨酸的濃度的線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.9948。在細(xì)胞環(huán)境中，用顯微鏡觀察，探針能快速地與細(xì)胞內(nèi)巰基化合物結(jié)合發(fā)出強(qiáng)熒光。該探針具有良好的光穩(wěn)定性、低毒性和生物兼容性。運(yùn)用HPLC-FL定量測定了HepG2肝癌細(xì)胞中的三種