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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以慢性多關(guān)節(jié)滑膜炎,骨及軟骨破壞為主要特征的全身性自身免疫性疾病。在我國(guó)是一種常見(jiàn)病、多發(fā)病。雖然目前其確切的發(fā)病機(jī)制尚不明確,但一般認(rèn)為,自身反應(yīng)性T細(xì)胞在局部的形成是該病重要的起動(dòng)因素之一。近幾年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)新的輔助性T細(xì)胞新亞群,主要有調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞,在包括RA在內(nèi)的多種自身免疫性疾病的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。本研究目的:建立調(diào)
2、節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)方法,探明RA時(shí)這兩種新亞群在外周血中的分布特征;然后進(jìn)一步分析導(dǎo)致該免疫狀態(tài)的分子機(jī)制,明確Notch信號(hào)分子在RA外周血T細(xì)胞中的表達(dá)特性;最后再證實(shí)Notch信號(hào)可能通過(guò)參與輔助性T細(xì)胞的功能性分化介導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。通過(guò)本研究可望進(jìn)一步明確RA的發(fā)病機(jī)制并為發(fā)展基于干預(yù)Notch信號(hào)的免疫治療提供理論依據(jù)。
方法:
1、建立流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞內(nèi)染色技術(shù)檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞
3、和Th17細(xì)胞的方法。外周血單個(gè)核細(xì)胞表面分子標(biāo)記后,再經(jīng)固定/透膜處理進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞內(nèi)FoxP3或IL-17。同時(shí)分析不同刺激劑對(duì)Th17細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果的影響。
2、選取活動(dòng)期及穩(wěn)定期RA患者,采用流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞內(nèi)染色技術(shù)檢測(cè)外周血中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞百分比。并應(yīng)用定量PCR的方法,分別檢測(cè)這兩種細(xì)胞特異的轉(zhuǎn)錄因子FoxP3與RORγt的mRNA表達(dá)水平。并與正常人結(jié)果進(jìn)行比較。
4、 3、RA患者同時(shí)檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞百分比,計(jì)算Th17/Treg比值。同時(shí)采用流式芯片技術(shù)檢測(cè)血清中11種細(xì)胞因子,觀察外周血中細(xì)胞因子微環(huán)境特征,并分析與Th17/Treg比值的相關(guān)性。
4、采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)RA外周血T細(xì)胞Notch受體分子的表達(dá)。應(yīng)用免疫磁珠分離純化外周血T細(xì)胞,通過(guò)定量PCR的方法檢測(cè)Notch受體及靶基因的mRNA表達(dá)水平。應(yīng)用Western Blot檢測(cè)T細(xì)胞內(nèi)Notch胞內(nèi)
5、段(Notchintra-cellular domain,NICD)核移位。
5、采用Ⅱ型膠原加弗氏完全佐劑免疫DBA/1J小鼠,取脾臟單個(gè)核細(xì)胞體外培養(yǎng),同時(shí)加入Ⅱ型膠原,從而建立膠原特異的體外增殖系統(tǒng)。采用多種方法包括:Notch信號(hào)非特異的阻斷劑DAPT、Notch受體的單克隆抗體、Notch配體的融體蛋白來(lái)干預(yù)膠原特異的體外增殖反應(yīng),觀察對(duì)T細(xì)胞增殖及Th1和Th17極化的影響。
結(jié)果:
6、 1、FoxP3分子主要表達(dá)于CD4+T細(xì)胞,尤其是高表達(dá)CD25的CD4+T細(xì)胞,達(dá)97%左右。同時(shí)中等程度表達(dá)CD25的細(xì)胞中也含有少量FoxP3陽(yáng)性細(xì)胞。T細(xì)胞活化后,表達(dá)FoxP3的CD4+CD25+T細(xì)胞比例顯著增高,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果與定量PCR結(jié)果一致。
2、RA患者CD4和CD25雙陽(yáng)性細(xì)胞所占比例與對(duì)照組沒(méi)有明顯差異,而活動(dòng)期患者外周血CD4+CD25high和CD4+CD25+FoxP3+細(xì)胞明顯低于穩(wěn)
7、定期和對(duì)照組(p<0.05)。活動(dòng)期RA患者外周血CD3+CD8-IL-17+細(xì)胞(Th17細(xì)胞)明顯多于穩(wěn)定期,二者均多于正常對(duì)照組(P<0.05)。RA患者外周血Th1細(xì)胞呈現(xiàn)與Th17細(xì)胞類(lèi)似的分布特點(diǎn)。
3、穩(wěn)定期組Th17/Treg比值(0.29±0.13)明顯高于健康對(duì)照組(0.11±0.4)?;顒?dòng)期組Th17/Treg比值增加更為明顯,達(dá)1.31±0.5。穩(wěn)定期患者血清中Th1和Th17相關(guān)細(xì)胞因子明顯增多,
8、如IL-12,IFN-γ,IL-2,IL-6,IL-1β和TNF-α(P<0.05)。但穩(wěn)定期組此類(lèi)因子水平又低于活動(dòng)期組(P<0.05)。與對(duì)照組相比,血清IL-4,IL-5,IL-10水平在穩(wěn)定期組及活動(dòng)期組均明顯升高,但兩疾病組間沒(méi)有明顯差異(P>0.05)。三組間血清IL-8,TNF-β水平未見(jiàn)明顯差異(P>0.05)。Th17/Treg比值與血清IFN-γ(r=0.650,P<0.05),IL-6(r=0.813,P<0.01
9、),IL-1β(r=0.713,P<0.01),和TNF-α(r=0.6263,P<0.05)均呈顯著正相關(guān)。
4、與正常人相比,RA患者T細(xì)胞Notch2、Notch3及Notch4表達(dá)量增加(P<0.01),其中Notch3主要表達(dá)于活化的T細(xì)胞,而Notch1水平在二者間未見(jiàn)明顯差異。全細(xì)胞NICD水平在RA活動(dòng)期、穩(wěn)定期及對(duì)照間無(wú)明顯差異,但活動(dòng)期組細(xì)胞核中的NICD水平明顯高于后兩者,即出現(xiàn)明顯NICD核移位
10、r> 5、膠原特異性體外增殖體系中分泌Th1細(xì)胞和Th17細(xì)胞百分比明顯增加(P<0.05)。刺激前后調(diào)節(jié)性T(CD4+CD25+FoxP3+)百分比未見(jiàn)明顯變化(P>0.05)。膠原再次刺激可誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞Hes1 mRNA表達(dá)水平增加。Notch3受體分子mRNA水平也明顯增加,但其它三種受種分子未見(jiàn)明顯變化。DAPT和Notch3的單克隆抗體均能抑制膠原特異性T細(xì)胞增殖及向Th1和Th17方向分化。Delta-like1
11、融合蛋白促進(jìn)膠原特異性T細(xì)胞向Th1和Th17方向分化,未影響到調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的百分比。
結(jié)論:
1、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者外周血存在Treg/Th17失衡,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)百分比下降,而Th17細(xì)胞比例明顯增加,呈現(xiàn)向Th17細(xì)胞優(yōu)勢(shì)極化的格局。
2、流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞內(nèi)染色技術(shù)可在單細(xì)胞水平檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞,轉(zhuǎn)錄因子FoxP3可作為調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測(cè)標(biāo)志物。
3、類(lèi)
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