核酸檢測重復(fù)無反應(yīng)性的血液HBV殘留風(fēng)險.pdf

1、目的：
　　乙型肝炎病毒(HBV)對人體危害嚴(yán)重并可以通過血液傳播，所以針對獻血者的血液篩查非常嚴(yán)格。在使用酶聯(lián)免疫法檢測HBsAg后，又進行了核酸檢測(NAT)，其高靈敏度的檢測能力大大降低HBV輸血傳播的風(fēng)險。在對HBsAg陰性血液進行Ultrio NAT單檢時發(fā)現(xiàn)有一部分出現(xiàn)HBV、HCV、HIV-1聯(lián)檢反應(yīng)性但病毒鑒別實驗為無反應(yīng)性的結(jié)果，即所謂的重復(fù)無反應(yīng)性(NRR)。盡管對血液采取了報廢措施、獻血者也進行了屏蔽，不會造

2、成經(jīng)血傳播病毒的風(fēng)險，但依照常規(guī)流程無法對血液檢測結(jié)果進行確認(rèn)。本研究的主要目的是利用PEG8000對血漿中的病毒進行富集，采用高靈敏度的實時熒光定量PCR和巢式PCR對NAT重復(fù)無反應(yīng)性結(jié)果進行確認(rèn)。
　　方法：
　　1.試驗室實時熒光定量PCR和巢式PCR試驗體系的確立。WHO HBV標(biāo)準(zhǔn)品采用磁珠法提取HBV DNA后按比例稀釋，確定本實驗室的HBV實時熒光定量PCR檢測體系的最小檢出限。對臨床陽性樣本S1進行定量，以

3、此替代WHO標(biāo)準(zhǔn)品確定本實驗室自有的HBV PreS/S巢式PCR和HBV S巢式PCR的最小檢出限。
　　2.PEG富集血漿HBV病毒方法的建立及富集效率的驗證。采用陰性血漿對陽性樣本S1按比例稀釋，等體積加入PEG8000(6ml)后離心沉降，磁珠法提取HBVDNA，采用自有的實時熒光定量PCR進行定量，計算富集效率。
　　富集效率=實際測量值/理論值*100％。
　　對15個NRR和5個OBI樣本進行PEG800

4、0富集病毒后巢式PCR檢測HBVPreS/S、S區(qū)段與Elite體系12次重復(fù)檢測（出現(xiàn)1次及以上反應(yīng)性即為檢出）、超高速離心富集病毒巢式PCR檢測HBV PreS/S、S區(qū)段結(jié)果比較。
　　3.對Ultrio NRR樣本進行電化學(xué)發(fā)光A-HBc、HBsAg檢測;進行實時熒光定量PCR的檢測;進行巢式PCR HBV PreS/S、S區(qū)段的檢測;進行Ultrio試劑2遍聯(lián)檢和1遍鑒別檢測，計算并比較不同方法對Ultrio NRR樣本

5、的陽性檢出率。
　　結(jié)果：
　　1.自有實時熒光定量PCR HBV檢測95％檢出限為10IU/mL。陽性樣本S1病毒濃度為5×105IU/mL。當(dāng)病毒載量達到2.5IU/mL時，用巢式PCR檢測HBVS區(qū)段可以穩(wěn)定檢出;當(dāng)病毒載量達到5IU/mL時，用巢式PCR檢測HBV PreS/S區(qū)段可以穩(wěn)定檢出。
　　2.PEG8000富集HBV病毒的效率為46.3％，95％置信區(qū)間為33.7％-58.8％。Elite體系可檢出

6、全部5個OBI樣本，15個Ultrio Plus NRR樣本檢出6個，總檢出率為55％。PEG8000富集病毒(6mL)方法利用實時熒光定量PCR和巢式PCR對PreS/S、S區(qū)段的檢測，對于5個OBI也全部檢出，15個Ultrio Plus NRR樣本也檢出6個，總檢出率為55％。PEG8000富集病毒方法可以達到多次重復(fù)試驗的檢出水平。
　　超高速離心富集病毒的方法(12mL)利用巢式PCR對樣本PreS/S、S區(qū)段進行檢測，

7、5個OBI樣本檢出4個，15個Ultrio Plus NRR樣本檢出5個，總檢出率為45％。通過PEG8000富集病毒(6mL)方法利用巢式PCR對PreS/S、S區(qū)段的檢測，對于5個OBI也全部檢出，15個Ultrio Plus NRR樣本也檢出5個，總檢出率為50％。PEG8000富集病毒方法可以達到超高速離心富集病毒方法的檢出水平。
　　3.在123個Ultrio NRR樣本中，不同方法總共確認(rèn)陽性數(shù)為31個，占試驗樣本的2

8、5.2％，其中A-HBc陽性的樣本為25/31個，占80.6％。PEG病毒富集方法確認(rèn)的陽性數(shù)(HBV檢出率)高于Ultrio體系的重復(fù)檢測，經(jīng)x2檢驗差異具有顯著性(P＜0.01)。Ultrio NRR確認(rèn)陽性獻血者中首次獻血者占比為54.8％，重復(fù)獻血者為45.2％。Ultrio NRR樣本利用PEG病毒富集后病毒定量，共有24個樣本陽性，其中病毒載量＜10IU/mL的樣本15個，占62.5％;病毒載量≥10、＜20IU/mL的樣本

9、5個，占20.8％;病毒載量≥30、＜1001U/mL的樣本4個，占16.7％。
　　結(jié)論：
　　1.建立了PEG8000富集病毒HBV檢測方法，提高了HBV檢出率，有助于Ultrio NRR樣本的確認(rèn)。
　　2.Ultrio NRR血液存在一定的HBV殘留風(fēng)險。
　　3.PEG病毒富集方法HBV檢出率顯著高于Ultrio體系檢測HBV。
　　4.重復(fù)獻血者在Ultrio NRR確認(rèn)陽性的獻血者中占有很高比