一些重要基因標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性的篩選及其與創(chuàng)傷并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)性的臨床多中心關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、研究背景：
　　 嚴(yán)重創(chuàng)傷是一個(gè)危害公共健康的世界性難題，已成為世界第四大常見死亡原因。嚴(yán)重創(chuàng)傷患者在傷后往往并發(fā)膿毒癥和多器官衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥，并導(dǎo)致最終死亡。對(duì)人類健康和社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展已構(gòu)成巨大的負(fù)面影響，因而是目前全球范圍內(nèi)危重病醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的重大科學(xué)問題。雖然目前膿毒癥的治療方法眾多，但是膿毒癥的治療水平并無明顯的提高。膿毒癥雖然不是遺傳病，但是感染引發(fā)的炎癥反應(yīng)是以機(jī)體內(nèi)眾多基因的表達(dá)變化為基礎(chǔ)的。膿毒癥表型和預(yù)后

2、的差異在很低程度上取決于炎癥反應(yīng)的程度?，F(xiàn)已研究表明，基因組上的變異，即基因多態(tài)性是造成個(gè)體間感染反應(yīng)差異性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，從基因背景上深化研究感染引發(fā)炎癥反應(yīng)的發(fā)生規(guī)律及其與膿毒癥風(fēng)險(xiǎn)性和預(yù)后的關(guān)系，不僅為進(jìn)一步揭示膿毒癥的發(fā)病機(jī)制提供新的理論認(rèn)識(shí)，更重要的是，這些新的研究技術(shù)將有可能從遺傳背景上準(zhǔn)確判斷病人并發(fā)膿毒癥的風(fēng)險(xiǎn)性和預(yù)后，為膿毒癥病人個(gè)體化治療提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)基于功能性基因突變可研制出更有針對(duì)性的新的治療方法，甚至

3、有可能開創(chuàng)膿毒癥基因治療的新紀(jì)元。
　　 白細(xì)胞介素-10是T細(xì)胞輔助產(chǎn)生的以抑制Th1細(xì)胞克隆的細(xì)胞因子合成為特點(diǎn)的多效免疫調(diào)節(jié)因子。近年來白細(xì)胞介素-10在創(chuàng)傷后并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展過程的毒作用日益受到重視，一般認(rèn)為嚴(yán)重創(chuàng)傷后機(jī)體白細(xì)胞介素-10合成和釋放水平顯著增加，與機(jī)體創(chuàng)傷后發(fā)生免疫功能麻痹有非常密切的關(guān)系。宿主免疫細(xì)胞表面模式識(shí)別受體是免疫系統(tǒng)感知病原菌入侵以及病原菌引起免疫反應(yīng)的首要環(huán)節(jié)。脂多糖結(jié)合蛋白和髓樣分化蛋白2是

4、很重要的模式識(shí)別受體分子。脂多糖結(jié)合蛋白不僅在脂多糖的識(shí)別和革蘭氏陰性菌感染中有重要作用，在革蘭氏陽性菌的感染中也有重要作用。MD-2能通過改變TLR4 胞外區(qū)的構(gòu)型而增強(qiáng)其對(duì)LPS的親和力。高遷移率蛋白-1和其配體-糖基化終產(chǎn)物受體也是膿毒癥發(fā)生過程中的重要分子?；诖?，這些創(chuàng)傷后膿癥和多器官功能不全發(fā)生重要的重要基因的標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性被作為研究對(duì)象，進(jìn)行基因分型，統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)分析以及后續(xù)的體內(nèi)體外功能研究和臨床關(guān)聯(lián)研究。
　　

5、 材料與方法：1. 樣本。本研究收集了重慶和浙江兩個(gè)地區(qū)的嚴(yán)重創(chuàng)傷患者DNA 樣本。所有采集的樣本均為居住在中國(guó)的漢族人，相互間無血緣關(guān)系。重慶地區(qū)的樣本來自于2005年1月至2010年7月重慶市大坪醫(yī)院創(chuàng)傷中心和重慶市急救中心收集的患者血樣；浙江地區(qū)的樣本來自于2007年1月至2010年7月浙江大學(xué)第二附屬醫(yī)院創(chuàng)傷與急救中心收集的患者血樣?；颊呒{入標(biāo)準(zhǔn)為：(1)創(chuàng)傷后24小時(shí)內(nèi)；(2)ISS 評(píng)分≥16分；(3)年齡≥18歲且≤65

6、歲，性別不限；(4)存活時(shí)間超過1周。
　　 2.標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性的篩選。LBP, HMGB1, RGAE和MD-2基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游3-10kb 至其終止子下游3-10kb 范圍及基因所有內(nèi)含子和外顯子范圍內(nèi)進(jìn)行標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性的篩選?；蚍中唾Y料來源于人類單體型圖計(jì)劃（HapMap，www.hapmap.org）的45例中國(guó)北京漢族人群。用Haploview 軟件構(gòu)建基因的單倍域，其標(biāo)準(zhǔn)是，若一段區(qū)域內(nèi)95％以上的S

7、NP 之間D’值的95％可信區(qū)間上限大于0.98，下限大于0.7，則說明該區(qū)域在遺傳上幾乎沒有發(fā)生重組，該組SNP構(gòu)成一個(gè)單倍域。利用Tagger 軟件在單倍域內(nèi)進(jìn)行標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性的篩選。
　　 3.基因分型。采用焦磷酸測(cè)序法對(duì)LBP，HMGB1，MD-2和RAGE基因進(jìn)行標(biāo)簽SNPs的分型。焦磷酸測(cè)序法是一個(gè)基于測(cè)序的可靠的SNP分型方法，按照儀器說明反應(yīng)在28°C 進(jìn)行，儀器根據(jù)每個(gè)堿基的峰高進(jìn)行結(jié)果的自動(dòng)判讀。采用RF

8、LP-PCR對(duì)白細(xì)胞介素-10基因進(jìn)行分型?；蚍中徒Y(jié)果均通過隨機(jī)抽取10％進(jìn)行第二次分型確認(rèn)。
　　 4.細(xì)胞因子表達(dá)水平檢測(cè)：取嚴(yán)重創(chuàng)傷患者入院后第一天全血，37°C，100ng/mlLPS 刺激4小時(shí)后，離心收集血漿。用ELISA 方法檢測(cè)血漿細(xì)胞因子表達(dá)水平，方法參照試劑盒說明書。
　　 5.蛋白分子模建。殺菌性/通透性增加蛋白（BPI）與LBP蛋白有高度的同源性，以已知晶體結(jié)構(gòu)的BPI 結(jié)構(gòu)為模板，對(duì)LBP 進(jìn)

9、行晶體結(jié)構(gòu)模建。通過幾何距離測(cè)量的方法，對(duì)氨基酸之間的距離，疏水口袋的面積和體積進(jìn)行了分析。用Discover_3 模塊對(duì)范德華力進(jìn)行計(jì)算。
　　 6.獲取重組人野生和突變LBP蛋白。以肝組織RNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用PCR的擴(kuò)增的方法獲得人LBP基因的cDNA 全長(zhǎng)片段。將之插入pCI-neo 質(zhì)粒的EcoRIsite和XbaI 位點(diǎn)之間。用位點(diǎn)特異的點(diǎn)突變的方法獲得26877T→C 突變。重組質(zhì)粒送公司進(jìn)行測(cè)序。用野

10、生和突變兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染后24小時(shí)的上清進(jìn)行人LBP ELISA 檢測(cè)，以確定LBP的表達(dá)水平。
　　 7.rs2232618對(duì)LPS 結(jié)合及轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。將Raw264.7細(xì)胞的上清更換為無血清培養(yǎng)基后，用200ng/ml的野生和突變LBP蛋白，100ng/ml LPS 或FITC-LPS 進(jìn)行刺激，收集上清進(jìn)行TNF-αELISA 檢測(cè)。PBS 清洗細(xì)胞后，進(jìn)行熒光強(qiáng)度檢測(cè)。
　　 8. Rs22326

11、18對(duì)LBP與CD14 結(jié)合的影響。用ELISA的方法來檢測(cè)重組LBP蛋白與CD14的結(jié)合力。在酶標(biāo)板上包被10μg/ml CD14蛋白。PBS 清洗5 遍后，用100ng/mlLPS與重組野生及突變LBP蛋白混合加入包被的孔中，37 °C 反應(yīng)1小時(shí)。用山羊抗人LBP 一抗及辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗山羊的二抗來檢測(cè)與CD14 結(jié)合的LBP的量。酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔的OD值。
　　 9. Rs1800625 (-429T/C)對(duì)RAGE

12、基因啟動(dòng)子活性的影響。為進(jìn)一步明確-429T/C對(duì)RAGE 啟動(dòng)子活性的影響，用PCR 方法以野生型DNA 樣本為模版，擴(kuò)增RAGE啟動(dòng)子-597～+26bp 片段，構(gòu)建pGL3BH-TT 質(zhì)粒。通過定點(diǎn)突變，構(gòu)建pGL3BH-CC質(zhì)粒。將兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U-937細(xì)胞系，通過化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀觀察堿基改變對(duì)啟動(dòng)子活性的影響。
　　 10. 臨床關(guān)聯(lián)研究：膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)有病原菌培養(yǎng)證據(jù)；(2)體溫高于38.5℃或低于36.5℃；

13、(3)白細(xì)胞計(jì)數(shù)高于10×109/L 或低于4×109/L。根據(jù)患者呼吸功能（氧合指數(shù)）、腎功能（血漿肌酐濃度）、肝功能（血漿膽紅素濃度）、心血管功能（血壓調(diào)整后心率）、凝血功能（血小板計(jì)數(shù)）和中樞神經(jīng)系統(tǒng)（格拉斯哥評(píng)分）等變化計(jì)數(shù)器官功能障礙評(píng)分。創(chuàng)傷ISS 評(píng)分采用簡(jiǎn)明損傷定級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(1998 版)。
　　 11. 統(tǒng)計(jì)分析：各SNP的等位基因型頻率由基因計(jì)數(shù)獲得。H-W平衡采用卡方檢驗(yàn)計(jì)算。組間熒光素酶活性通過單因素方差分析

14、比較。多態(tài)性與MODS 評(píng)分、細(xì)胞因子表達(dá)水平間的關(guān)系采用單因素方差方法統(tǒng)計(jì)。等位計(jì)量效應(yīng)采用線性回歸分析統(tǒng)計(jì)，并用年齡、性別及ISS 評(píng)分校正。顯性及隱性遺傳模式下各基因型與膿毒癥發(fā)生率之間的關(guān)系采用卡方檢驗(yàn)方法統(tǒng)計(jì)。等位計(jì)量效應(yīng)采用多重Logister 回歸分析計(jì)算，并對(duì)年齡、性別及ISS 評(píng)分校正。檢驗(yàn)效能通過在線軟件Power and Sample Size Programsoftware (http://biostat.mc.

15、vanderbilt.edu/twiki/bin/view/Main/PowerSampleSize)計(jì)算。
　　 結(jié)果：
　　 1.IL-10的-1082 位點(diǎn)與膿毒癥的發(fā)生密切相關(guān)，A等位基因攜帶者患創(chuàng)傷后膿毒癥和MODs的幾率明顯增高。-1082A，-592A等位基因和ATA 單體型與低血漿IL-10水平有關(guān)；
　　 2.通過對(duì)重慶和浙江人群統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)分析，我們發(fā)現(xiàn)LBP rs2232618 C等位基因攜帶

16、者患創(chuàng)傷后膿毒癥及MODs的幾率顯著高于T等位基因攜帶者。LBP蛋白第436位氨基酸是高度保守的，其由苯丙氨酸被亮氨酸替代以后可能導(dǎo)致LBP蛋白的C 端活性中心的結(jié)構(gòu)改變，突變后范德華能減小，導(dǎo)致分子構(gòu)型穩(wěn)定性減低，從而使疏水口袋變大，可能更容易與CD14 結(jié)合。轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞獲得野生和突變兩個(gè)蛋白，用重組蛋白進(jìn)行LPS 結(jié)合和刺激實(shí)驗(yàn)表明，突變蛋白刺激巨噬細(xì)胞后，細(xì)胞分泌TNF-α的水平顯著高于野生蛋白，且轉(zhuǎn)運(yùn)LPS的能力也顯著高于野

17、生蛋白。我們用ELISA的方法直接檢測(cè)兩個(gè)重組蛋白與CD14蛋白的結(jié)合力大小的實(shí)驗(yàn)顯示，突變蛋白與CD14結(jié)合能力明顯高于野生蛋白（P=0.043）。這表明，rs2232618 多態(tài)性可能通過影響LBP蛋白C 端活性中心的結(jié)構(gòu)從而影響了LBP蛋白與下游CD14分子的結(jié)合能力，突變LBP蛋白更易與CD14分子結(jié)合，使其傳遞LPS的能力增強(qiáng)，更易于激發(fā)炎癥反應(yīng)。因此我們推斷，rs2232618不僅是一個(gè)影響LBP蛋白功能的重要多態(tài)性位點(diǎn)，也

18、是一個(gè)預(yù)警創(chuàng)傷后并發(fā)癥的分子標(biāo)記。
　　 3.在HMGB1的3個(gè)標(biāo)簽SNPs中，只有rs2249825與LPS 刺激血漿后HMGB1
　　 水平相關(guān)。Rs2249825是一個(gè)位于內(nèi)含子1的C→G 突變，會(huì)改變v-Myb 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，v-Myb是一個(gè)HMGB1表達(dá)的強(qiáng)的增強(qiáng)子（1）。與此一致的是，rs2249825與創(chuàng)傷后膿毒癥和MODs 發(fā)生密切相關(guān)。而另外2個(gè)標(biāo)簽SNPs（rs1412125和rs1045411）不

19、影響患者創(chuàng)傷后的并發(fā)癥發(fā)生率。
　　 4．通過對(duì)重慶和浙江兩個(gè)地區(qū)創(chuàng)傷人群的關(guān)聯(lián)分析，MD-2的3個(gè)標(biāo)簽SNPs中，只有rs11465996與創(chuàng)傷后膿毒癥和MODs的發(fā)生均密切相關(guān)。該結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致（2），我們前期已證實(shí)，-1625C/G（rs11465996）是一個(gè)影響MD-2 啟動(dòng)子活性的有功能的位點(diǎn)。
　　 5.RGAE基因rs1800625（-429T/C）是一個(gè)與創(chuàng)傷后膿毒癥和MODs 發(fā)生密切相

20、關(guān)的位點(diǎn)，T等位基因攜帶者有更高的患病率。熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)，-429C 會(huì)減弱RAGE 啟動(dòng)子活性。
　　 結(jié)論：
　　 IL-10基因的-1082A/G，LPB基因的rs2232618，HMGB1基因的rs2249825，MD-2基因的rs11462996及RAGE基因的rs1800625 都是與創(chuàng)傷后膿毒癥和MODS 發(fā)生密切相關(guān)的多態(tài)性位點(diǎn)。LBP基因的rs2232618（Phe436Leu）是一個(gè)影響LBP蛋