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文檔簡介
1、目的: 1 構(gòu)建含TAT蛋白轉(zhuǎn)導域(protein transductiondomain,PTD)與HO-1(血紅素氧合酶-1,熱休克蛋白32)融合基因片斷的原核表達質(zhì)粒TAT-HO-1-pET32a,表達、純化TAT-HO-1-pET32a蛋白并鑒定其酶活、細胞毒性和體外/體內(nèi)進入肝細胞的轉(zhuǎn)導活性。 2 建立將TAT-HO-1-pET32a蛋白轉(zhuǎn)導入體外培養(yǎng)的PLC細胞及SD大鼠肝臟細胞的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導系統(tǒng)。 3
2、建立成年SD大鼠的肝臟部分再灌注損傷模型。 4 探討TAT-HO-1-pET32a融合蛋白(血紅素氧合酶-1,熱休克蛋白32)對L-02細胞凋亡的保護作用。 5 探討TAT-HO-1-pET32a融合蛋白對SD大鼠肝臟部分再灌注損傷的保護作用,以期為實現(xiàn)臨床應用蛋白轉(zhuǎn)導HO-1技術(shù)以減輕肝臟部分再灌注損傷而奠定基礎(chǔ)。 方法: 1 采用PCR及克隆技術(shù)將HO-1編碼區(qū)基因與TAT-PTD連接到原核表達載體p
3、ET32a上,通過酶切及測序鑒定表達載體TAT-HO-1-pET32a質(zhì)粒是否正確。選取正確的TAT-HO-1-pET32a質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli BL-21,用IPTG誘導E.coli BL-21表達TAT-HO-1-pET32a融合蛋白,通過Ni-NTA-agarose純化TAT-HO-1-pET32a融合蛋白,通過SDS-PAGE、Western-Blot鑒定融合蛋白。 2 測定TAT-HO-1-pET32a融合蛋白的酶活性,用CC
4、K-8 kit檢測TAT-HO-1-pET32a融合蛋白是否具有細胞毒性,通過將TAT-HO-1-pET32a融合蛋白加入體外培養(yǎng)的PLC細胞培養(yǎng)基中及自尾靜脈注射入SD大鼠體內(nèi)來檢測TAT-HO-1-pET32a融合蛋白體外/體內(nèi)進入細胞的轉(zhuǎn)導活性。 3 體外培養(yǎng)L-02細胞實驗分組一:(Ⅰ)正常對照組(n=4); (Ⅱ)THF-α(5000u/mL)l+CHX(1.5mg/mL)處理24h(n=4); (Ⅲ)THF-α(50
5、00u/mL)+CHX(1.5mg/mL)處理24h前加蛋白TAT-HO-1-pET32a(10μg/mL)作用4h(n=4): (Ⅳ)THF-α(5000u/mL)+CHX(1.5mg/mL)處理24h前加蛋白TAT-HO-1-pET32a(100μg/mL)作用4h(n=4)。通過CCK-8 kit檢測TAT-HO-1-pET32a蛋白對細胞凋亡的保護作用。 4 體外培養(yǎng)L-02細胞實驗分組二:(Ⅰ)正常對照組(n=4);
6、(Ⅱ)THF-a(5000u/mL)+CHX(1.5mg/mL)處理24h(n=4);(Ⅲ)THF-a(5000u/mL)+CHX(1.5mg/mL)處理24h前加蛋白TAT-HO-1-pET32a(100μg/mL)作用4h(n=4)。通過AO-PI檢測TAT-HO-1-pET32a蛋白對L-02細胞凋亡的保護作用。 5 參照Nauta法建立成年SD大鼠的肝臟部分再灌注損傷模型;動物實驗分組:(Ⅰ)正常對照組(n=6只),只行
7、假手術(shù),給予開腹及暴露左、中肝葉肝蒂處理,不阻斷肝葉供血;(Ⅱ)缺血再灌注損傷組(n=6只),左、中肝葉缺血60min,再灌注6 h:(Ⅲ)TAT-HO-1-pET32a組(n=6只),缺血前自尾靜脈注射TAT-HO-1-pET32a蛋白(10mg/kg)作用4h,左、中肝葉缺血60min,再灌注6 h;(Ⅳ)HO-1-pET32a蛋白組(n=6只),缺血前自尾靜脈注射HO-1-pET32a蛋白(10mg/kg)作用4h,左、中肝葉缺血
8、60min,再灌注6h。各組動物分別通過肝上下腔靜脈取血約2mL,并取肝臟標本,-80℃凍存留作檢測用,后處死。 6 動物標本檢測:分別檢測血清ALT、AST及組織中 SOD、MDA、MPO含量,缺口末端標記法(TUNEL)檢測凋亡細胞,光鏡下肝組織病理形態(tài)學觀察。 結(jié)果: 1 質(zhì)粒TAT-HO-1-pET32a測序正確,融合蛋白TAT-HO-1-pET32a在E.coli BL-21中經(jīng)IPTG誘導獲得高效表達、并成功
9、純化,經(jīng)Western-Blot定性鑒定為TAT-HO-1-pET32a蛋白,CCK-8 kit檢測融合蛋白無細胞毒性,酶活檢測融合蛋白的酶活性質(zhì)穩(wěn)定,可轉(zhuǎn)導入在體外培養(yǎng)的PLC細胞和SD大鼠的肝細胞。 2 加蛋白TAT-HO-1-pET32a(10μg/mL)作用4h可將用THF-a(5000u/mL)+CHX(1.5mg/mL)處理24h的體外培養(yǎng)的L-02細胞的生存率從25.52%±0.47%提高到41.76%±5.49%
10、,加蛋白TAT-HO-1-pET32a(100μg/mL)作用4h可將L-02細胞的生存率從25.52%±0.47%提高到52.98%±6.29%。 3 與正常對照組相比再灌注損傷組、TAT-HO-1-pET32a組、HO-1-pET32a組的血清ALT、AST的水平顯著升高(P<0.05)、超氧化物歧化酶SOD水平顯著降低(P<0.05)、丙二醛MDA水平顯著增高(P<0.05)、髓過氧化物酶MPO水平顯著增高(P<0.05)
11、,光鏡下組織學觀察肝組織損害明顯嚴重。TAT-HO-1-pET32a組與再灌注損傷組相比血清ALT、AST的水平顯著降低(P<0.05)、超氧化物歧化酶SOD水平顯著增高(P<0.05)、丙二醛MDA水平顯著降低(P<0.05)、髓過氧化物酶MPO水平顯著降低(P<0.05):光鏡下組織學觀察肝組織損害明顯減輕:凋亡指數(shù)為34.28%±3.00%,顯著低于再灌注損傷組的56.12%±1.71%(P<0.05)。HO-1-pET32a組與
12、TAT-HO-1-pET32a組相比血清ALT、AST的水平顯著升高(P<0.05)、超氧化物歧化酶SOD水平顯著降低(P<0.05)、丙二醛MDA水平顯著增高(P<0.05)、髓過氧化物酶MPO水平顯著增高(P<0.05);光鏡下組織學觀察肝組織損害明顯加重;凋亡指數(shù)為56.96%±2.63%,顯著高于TAT-HO-1-pET32a組的34.28%±3.00%(P<0.05)。HO-1-pET32a組與再灌注損傷組相比血清ALT、AS
13、T的水平、超氧化物歧化酶SOD水平、丙二醛MDA水平、髓過氧化物酶MPO水平均無統(tǒng)計學差異(P>0.05);光鏡下組織學觀察肝組織損害程度較一致;凋亡指數(shù)為56.96%±2.63%,與再灌注損傷組的56.12%±1.71%相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。 結(jié)論: 1 成功構(gòu)建了原核表達載體TAT-HO-1-pET32a,得到了具有一定的酶活性、無細胞毒性并且可以體內(nèi)體外轉(zhuǎn)導入細胞的TAT-HO-1-pET32a蛋白,為
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