杉木炭疽病拮抗細(xì)菌的篩選及其菌劑研制.pdf

1、杉木炭疽病(Colletotrichumgloeosporioides)是杉木栽培區(qū)的主要發(fā)生病害。幾乎有杉木的地區(qū)就有炭疽病發(fā)生，且以低山丘陵地區(qū)人工幼林的發(fā)生較普遍且嚴(yán)重，常大面積發(fā)生。病輕時(shí)會(huì)導(dǎo)致杉木幼苗的針葉或嫩梢變褐枯萎，嚴(yán)重時(shí)常會(huì)造成杉木幼林成片的枯黃、枯死，造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，對(duì)杉木炭疽病的防治主要以化學(xué)防治為主，尚無(wú)生物防治的報(bào)道。本論文從杉木根際土壤中篩選炭疽病菌的拮抗細(xì)菌，對(duì)防治效果好的拮抗菌株進(jìn)行了鑒定及發(fā)

2、酵條件優(yōu)化，篩選了能夠提高菌株存活率的載體和助劑，研制成水分散性粒劑，并對(duì)該菌劑進(jìn)行了防效研究。
　　 研究結(jié)果如下:
　　 (1)杉木炭疽病拮抗細(xì)菌的篩選和鑒定。從杉木根際土壤中分離到拮抗細(xì)菌55株，通過(guò)平板對(duì)峙試驗(yàn)和液體發(fā)酵試驗(yàn)初篩，篩選到抑菌帶寬度大于等于4mm的菌株有11株。進(jìn)一步通過(guò)盆栽活體復(fù)篩，最終得到一株對(duì)杉木炭疽病有高效拮抗活性的菌株AM53。結(jié)合其菌落形態(tài)，生理生化特性及16srDNA序列分析，確定菌株

3、AM53是地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis。杉木炭疽病拮抗菌株AM53保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNo.M2012273。
　　 (2)杉木炭疽病拮抗細(xì)菌AM53發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。對(duì)菌株AM53的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行單因素試驗(yàn)，得到適宜菌株發(fā)酵的培養(yǎng)基:碳源為葡萄糖，氮源為酵母膏和蛋白胨，無(wú)機(jī)鹽為NaCl。以這些培養(yǎng)基組分為自變量，然后以600nm時(shí)AM53菌液的OD(opticaldens

4、ity)值作為響應(yīng)目標(biāo)，使用Design-Expert8.0軟件，利用響應(yīng)面方法(RSM)中的Box-Behnken(B-B)法對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化分析，得到拮抗菌AM53的最佳培養(yǎng)基配方為:葡萄糖19.80g/L，酵母膏12.16g/L，蛋白胨4.22g/L，NaCl13.13g/L。經(jīng)3次平行實(shí)驗(yàn)，所得實(shí)際AM53菌液平均OD值為1.743。
　　 杉木炭疽病拮抗細(xì)菌AM53發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化。單因子試驗(yàn)結(jié)果表明，初始pH、培養(yǎng)溫

5、度和搖床轉(zhuǎn)速是影響菌株生長(zhǎng)及其抑菌率的關(guān)鍵因素，然后采用Box-Behnken法對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行三因素三水平設(shè)計(jì)，并使用Design-Expert8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化分析，得出最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度30.52℃，初始pH8.09，搖床轉(zhuǎn)速184.67r/min。為了便于實(shí)際應(yīng)用，最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件修正為:培養(yǎng)溫度30.5℃，初始pH=8，搖床轉(zhuǎn)速185r/min。經(jīng)3次平行實(shí)驗(yàn)，所得實(shí)際AM53菌液平均OD值為1.861。

6、　　 (3)杉木炭疽病拮抗細(xì)菌AM53菌劑的研制。通過(guò)生物相容性的測(cè)定，載體硅藻土，潤(rùn)濕劑十二烷基硫酸鈉(SDS)，分散劑木質(zhì)素磺酸鈉、三聚磷酸鈉STPP，粘結(jié)劑聚乙烯醇、聚乙二醇、可溶性淀粉，崩解劑氯化鈣、硫酸銨、氯化鈉，它們對(duì)AM53菌株的芽孢萌發(fā)和菌落生長(zhǎng)沒(méi)有影響或影響比較小，可以用于下一步試驗(yàn)。以潤(rùn)濕性、分散性、懸浮性、崩解時(shí)間等作指標(biāo)，通過(guò)對(duì)潤(rùn)濕劑、分散劑、粘結(jié)劑、崩解劑等助劑的篩選，最終確定了菌株AM53水分散粒劑的組成及

7、含量，分別為菌株AM53的發(fā)酵液原液(＞8.0×1010cfu/ml)，潤(rùn)濕劑十二烷基硫酸鈉3.5％，分散劑木質(zhì)素磺酸鈉5％，崩解劑硫酸銨4％，粘結(jié)劑聚乙二醇2％，加水量控制在16-20％間，載體高嶺土補(bǔ)足100％。通過(guò)對(duì)該粒劑的保存溫度和保存時(shí)間研究，初步確定該粉劑可在常溫下存放，其貯存時(shí)間至少為2-6個(gè)月。盆栽試驗(yàn)和林間防效試驗(yàn)表明該菌劑對(duì)杉木炭疽病有較好的預(yù)防和治療效果，500倍的菌劑稀釋液的防治效果可達(dá)75％左右，與化學(xué)試劑多菌