抑肽酶-氨甲環(huán)酸改良可注射性纖維蛋白凝膠的體外實驗.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩66頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、關節(jié)軟骨缺損是臨床的難題之一,關節(jié)軟骨缺乏自身修復能力,是臨床上對創(chuàng)傷和關節(jié)炎所致的軟骨缺損難以取得滿意效果的主要原因。以往人們主要通過自體或異體軟骨移植、軟骨膜或骨膜移植、軟骨細胞移植等來研究及治療修復軟骨缺損。而自體關節(jié)軟骨移植存在來源有限、創(chuàng)傷大、費用高等缺點,異體關節(jié)軟骨移植難以排除免疫源性的問題。隨著組織工程的發(fā)展,利用人工再生組織來修復關節(jié)軟骨缺損,為臨床解決這一難題提供了新的思路和方法。雖然關節(jié)軟骨組織工程的研究已經(jīng)取得了

2、很大進展,但仍有大量的問題等待解決。 近年來,隨著組織工程和再生醫(yī)學的快速發(fā)展,尋找具有良好生物相容性和功能仿生性的生物材料正在成為該領域的研究熱點之一。在致力于合成和開發(fā)出新型生物材料的同時,人們也立足于對現(xiàn)有生物材料進行結(jié)構和功能改造,使之能夠最大限度仿生天然組織的成分、結(jié)構和功能特征,為細胞和組織生長提供最佳的生理環(huán)境,實現(xiàn)理想的功能替代。纖維蛋白基材料包括纖維蛋白原和纖維蛋白,是一種具有良好生物相容性和生物降解性能的天然

3、聚合物材料,早在20世紀70年代纖維蛋白膠就作為止血劑和封閉劑而被廣泛應用于臨床。后來人們通過對凝血機制的研究,認識到將纖維蛋白原和凝血酶在體外配合并應用于臨床可以得到很好的效果。近幾年纖維蛋白基材料用于組織工程支架中,由于纖維蛋白基材料具有良好的生物相容性和生物降解性能,現(xiàn)已被廣泛應用于開發(fā)各種組織工程支架和生長因子釋放系統(tǒng)。為滿足不同組織工程對支架三維結(jié)構和力學性能的要求,纖維蛋白基材料可以制成凝膠、黏膠、微珠和納米纖維,也可以單獨

4、使用或與其他材料復合。同特定成型的聚合物材料相比,可注射性的生物材料具有可以與細胞和(或)生長因子均勻混合,與修復組織之間嵌合連接好,塑型容易的特點,且能通過微創(chuàng)方式操作,治療簡單,安全,有效,另外可注射材料還適合于對細胞施加壓力使之產(chǎn)生應力刺激,因此可注射性的軟骨組織工程產(chǎn)品應該是臨床應用的發(fā)展方向。 但是纖維蛋白基材料自身的缺點,即降解速率過快和力學強度不夠等都限制了其更廣泛的應用??梢灶A見,隨著材料制備和復合技術的不斷發(fā)展

5、,纖維蛋白類材料將在組織工程中獲得個多的應用。文章旨在研究通過化學方法調(diào)節(jié)其不同組分的濃度來控制纖維蛋白凝膠支架的降解率,探討其在組織修復中的獨特作用,展望其用于組織工程材料的應用前景。 研究目的: 通過在可注射性纖維蛋白凝膠中引入不同濃度的抑肽酶和氨甲環(huán)酸,探索其對纖維蛋白凝膠支架的降解速率及對軟骨細胞的繁殖、表型的維持、基質(zhì)的分泌產(chǎn)生的影響及影響大小。在纖維蛋白凝膠支架的降解與軟骨細胞的繁殖、表型的維持、基質(zhì)的分泌之

6、間找到一最佳平衡點,為組織工程方法過渡到臨床做前期工作。 研究方法: 以細胞和支架材料為實驗對象,以標準組和改良組分組對照。質(zhì)量檢測分組:2個時間點:2周、3周。10個平行孔/組,10個培養(yǎng)組共200孔。 取3周齡新西蘭幼兔的關節(jié)軟骨制取軟骨細胞,體外單層培養(yǎng)、擴增后種植于纖維蛋白凝膠支架上,構建標準纖維蛋白凝膠支架細胞復合物和不同濃度的抑肽酶(7500KIU/ml、12500 KIU/ml、17500 KIU/

7、ml)及氨甲環(huán)酸(15mg/ml、20mg/ml、25 mg/ml)的改良纖維蛋白凝膠支架細胞復合物(實驗分九組,濃度由低到高),進行體外三維立體培養(yǎng)、擴增6周。觀察軟骨細胞在纖維蛋白凝膠支架上的形態(tài)變化,比較并觀察加入抑肽酶和氨甲環(huán)酸對軟骨細胞增殖的影響情況;支架培養(yǎng)1周內(nèi),行細胞計數(shù),繪制生長曲線;于培養(yǎng)第1天行掃描電鏡形態(tài)學觀察;分別于培養(yǎng)1周及2周后行透射電鏡下的組織形態(tài)學觀察,復合物于培養(yǎng)1周、2周后進行石蠟包埋、切片,行蘇木

8、精-伊紅染色及Ⅱ型膠原免疫組化檢測,觀察軟骨細胞的生物學性狀變化及加入抑肽酶和氨甲環(huán)酸對軟骨細胞的影響。分別于培養(yǎng)2周及3周后測量纖維蛋白凝膠支架細胞復合物質(zhì)量和載體降解情況,對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。 統(tǒng)計方法:同一時間點的各組纖維蛋白凝膠的剩余質(zhì)量比較采用完全隨機設計單因素方差分析(One-way ANOVA),各組之間多重比較用LSD法,全部數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示。全部數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學處理,

9、統(tǒng)計學檢驗水準為α=0.05。 研究結(jié)果: 1.細胞形態(tài):初接種時體外單層培養(yǎng)的軟骨細胞呈球形,懸浮在培養(yǎng)液中,5h后開始貼壁,細胞呈扁平狀,大多數(shù)三角形,或多角形,有較多突起,部分細長突起??缭郊毎c遠處的細胞突起相連結(jié);胞核呈圓形或橢圓形,居中或偏于一側(cè),輪廓清晰,可見1~3個核仁。細胞增殖旺盛,并能維持二倍體核型。約1周細胞鋪滿培養(yǎng)瓶,呈“鋪路石”樣。第2、3代細胞S-100免疫細胞化學染色胞漿內(nèi)呈陽性反應。當軟骨

10、細胞培養(yǎng)4代以后,隨著反復傳代細胞逐漸失去二倍體性質(zhì)并發(fā)生轉(zhuǎn)化。細胞中梭形細胞增多,胞漿內(nèi)空泡增多,核輪廓模糊,甚至無核仁。細胞分泌和增殖能力下降,傳代周期延長,以至完全停止。 2.細胞/支架光鏡下觀察:纖維蛋白凝膠以標準組出現(xiàn)改變較早,標準組于2天后即出現(xiàn)不規(guī)則裂紋,1周后支架各層面已布滿空泡,3周后已大部分崩解,而改良組多于1周后開始出現(xiàn)空泡,且明顯少于標準組,3周后改良組崩解尚不到原體積的1/2,標準組及實驗1、2、4、5

11、組鏡下可見軟骨細胞在空泡內(nèi)分裂增殖,改良7、8組一周后可見部分細胞分裂,細胞呈梭型,類似樹枝樣生長,呈現(xiàn)反分化現(xiàn)象,實驗9組體外培養(yǎng)9天細胞呈阿米巴樣改變,細胞分裂相少。改良5組體外培養(yǎng)3周可見軟骨陷窩。 3.細胞計數(shù)、繪制生長曲線:種子細胞和材料復合后,分別于培養(yǎng)的1~7天行胎盼蘭染色細胞計數(shù)并繪制細胞生長曲線,可以看出改良1、2、4、5組與標準組無明顯差異,而改良3、6、7、8、9組細胞生長明顯減慢。 4.質(zhì)量檢測:

12、標準纖維蛋白凝膠支架組與所有改良纖維蛋白凝膠支架組體外培養(yǎng)2周及3周后剩余質(zhì)量之間比較均有P<0.001,標準組與所有改良組降解速度有顯著性差異;改良1組與改良2、3、4、5、6、7、8、9組體外培養(yǎng)2周及3周后剩余質(zhì)量之間比較P<0.05,改良1組與改良2、3、4、5、6、7、8、9組降解速度有顯著性差異;改良5組與改良3、6、7、8、9組比較P>0.05,改良5組與改良3、6、7、8、9組降解速度無顯著性差異;改良5組與改良1、2、

13、4組比較P<0.05,改良5組與改良1、2、4組降解速度有顯著性差異;改良纖維蛋白凝膠支架細胞組在體外4周的培養(yǎng)過程中僅有少量崩解,標準纖維蛋白凝膠支架細胞組則完全崩解。 5.掃描電鏡及透射電鏡:培養(yǎng)第1天掃描電鏡下可見軟骨細胞黏附于纖維蛋白膠內(nèi)呈三維空間生長;培養(yǎng)1周、2周及3周后,標準組及改良1、5組等中、低濃度組透射電鏡下可見基質(zhì)的外分泌。而3、6、7組等高濃度組透射電鏡下可見基質(zhì)的外分泌明顯減少,改良9組甚至未見基質(zhì)的分

14、泌。 6.HE染色和免疫組化結(jié)果:HE染色可見標準組及改良1、2、4、5組1周及2周,支架內(nèi)部可見細胞聚集成團,細胞呈圓形或橢圓形,細胞團中有基質(zhì)分泌,沉積于細胞周圍,Ⅱ型膠原免疫組化檢測可見空泡內(nèi)軟骨細胞周圍均出現(xiàn)陽性棕色顆粒。改良3、6、7、8組Ⅱ型膠原免疫組化檢測軟骨細胞周圍棕色顆粒較少。改良9組軟骨細胞周圍未見棕色顆粒。 結(jié)論: 1.纖維蛋白凝膠具有良好的生物相容性,且免疫原性低。單純纖維蛋白凝膠中細胞生

15、長未見明顯異常,細胞的增殖、表型維持及分泌功能正常。 2.通過在纖維蛋白凝膠中引入不同濃度的抑肽酶和氨甲環(huán)酸,在體外環(huán)境下均可以顯著地減緩纖維蛋白膠的降解速度,濃度的高低與纖維蛋白凝膠支架的降解速率成反比。通過調(diào)節(jié)纖維蛋白凝膠中抑肽酶和氨甲環(huán)酸的濃度,可實現(xiàn)對纖維蛋白凝膠降解速度的調(diào)控。 3.不同濃度的抑肽酶和氨甲環(huán)酸對軟骨細胞的增殖和表型的維持有一定的影響。高濃度抑肽酶和氨甲環(huán)酸的加入明顯抑制了細胞的增殖,使軟骨細胞呈

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論