新型磁響應(yīng)性脂肪酶的開發(fā)及其催化合成生物柴油工藝的研究.pdf

1、在目前所研究的可再生清潔燃料中，生物柴油除了其可再生性及污染物排放少的優(yōu)良特性之外，還具有以下獨特之處:(1)可以與柴油進行任意比例混勻但不影響柴油的物理性質(zhì);(2)可完全被生物降解;(3)可直接用于現(xiàn)有的柴油發(fā)動機而不需對其進行任何改動。因此，良好的適應(yīng)性、安全性和經(jīng)濟性使生物柴油在眾多的可再生能源中脫穎而出，倍受科研工作者的廣泛關(guān)注。
　　在合成生物柴油的酯交換反應(yīng)中，酶催化轉(zhuǎn)化技術(shù)由于其良好的環(huán)境效應(yīng)而成為最有前景的生物柴油

2、合成方法。但現(xiàn)已開發(fā)的酶催化法大多存在脂肪酶價格昂貴、催化效率低等問題，使酶催化轉(zhuǎn)化技術(shù)往往不能同時兼顧生產(chǎn)成本及催化效率而難以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。因此，開發(fā)價格低廉、催化效率高的脂肪酶并將其應(yīng)用于生物柴油的合成具有非常重要的意義。本論文針對目前存在的問題，從脂肪酶的改造及生物柴油合成工藝的改進入手，以提高酶催化活力、降低酶的生產(chǎn)成本，做了以下工作。
　　(1)借鑒固定化思想，采用共價偶聯(lián)法，在疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶(Thermomyce

3、s lanuginosus lipase，TLL)分子上偶聯(lián)納米Fe3O4-COOH顆粒制備得到磁響應(yīng)性脂肪酶(magnetic responsive lipases，MRL)，通過外加磁場實現(xiàn)了脂肪酶的分離回收并考察了影響MRL合成過程的因素。在最佳偶聯(lián)反應(yīng)條件下所制備得到的MRL其酶活力為23.02 U/mL，比活力為93.18 U/mg;雖然其酶活力僅相當于純酶的31％，但比活力卻為純酶的128％。說明經(jīng)過納米Fe3O4-COOH

4、顆粒的修飾后，單位脂肪酶所具有的催化活性提高了。同時，通過合理估算納米Fe3O4-COOH顆粒濃度及表面游離羧基濃度，大致知道每個納米Fe3O4顆粒表面約含160-170個可供反應(yīng)的羧基;通過MRL的蛋白質(zhì)含量，推測了MRL分子中納米顆粒與脂肪酶分子的個數(shù)比為8;通過TEM(Transmission electron microscope)圖像分析，考察了脂肪酶的引入對納米Fe3O4顆粒分散性的影響;通過對不同溶液中納米Fe3O4顆粒及

5、MRL粒子的Zeta電位測定，分析了納米Fe3O4顆粒的引入對增加所制備的MRL復(fù)合物在水溶液中穩(wěn)定性的作用。
　　(2)通過XRD(X-ray diffractometer)、AFM(Atomic force microscope)、FTIR(Fourier transform infrared microscope)、XPS(X-ray photoelectronspectroscopy)等表征手段對游離TLL和MRL的晶體結(jié)

6、構(gòu)、三維形貌、分子結(jié)構(gòu)及表面元素進行了分析并預(yù)測了MRL的立體結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示經(jīng)納米Fe3O4-COOH顆粒的修飾合成了磁響應(yīng)脂肪酶，由于納米Fe3O4顆粒的存在而使酶的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，從對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的分析發(fā)現(xiàn)，其α-螺旋的增加和β-折疊含量的降低使酶的分子結(jié)構(gòu)變得更加穩(wěn)定;并以催化橄欖油水解反應(yīng)考察了游離TLL和MRL的催化特性。與游離TLL相比，所制備的MRL具有更高的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和貯藏穩(wěn)定性并且可以利用外加磁場進行分

7、離回收，其操作穩(wěn)定性良好。
　　(3)確定了MRL催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)制備生物柴油的工藝。通過響應(yīng)性設(shè)計，充分考慮影響生物柴油合成過程中的主要因素，得到了其最優(yōu)制備工藝。在最優(yōu)制備工藝下:醇油摩爾比為4，分三次等量加入甲醇，酶用量為豆油質(zhì)量的9％，體系含水量為1.5％，反應(yīng)溫度為41℃，反應(yīng)28h后豆油轉(zhuǎn)化率為81.48±0.77％，是游離TLL的1.2倍;分析了游離TLL和MRL在生物柴油合成過程中的?；D(zhuǎn)移現(xiàn)象，微量水的存在導(dǎo)致了s

8、n-2位上酰基的轉(zhuǎn)移，而且納米Fe3O4-COOH顆粒載體有利于sn-2位上?；霓D(zhuǎn)移從而提高了MRL的酯交換率;考察了MRL制備生物柴油的操作穩(wěn)定性，MRL在重復(fù)使用10個批次后其大豆油轉(zhuǎn)化率和脂肪酸甲酯（fatty acid methylesters，F(xiàn)AMEs）得率僅降低了10.96％，說明所制備的MRL的操作穩(wěn)定性好。與文獻相比，在獲得高轉(zhuǎn)酯化效率的同時，使酶的用量降低且實現(xiàn)了多次的重復(fù)使用。
　　(4)為進一步提高脂肪酶

9、合成生物柴油的催化效率，首次采用共固定化技術(shù)將具有1，3位酯鍵專一性的MRL與無位置專一性的擴展青霉脂肪酶(Penicillium expansum lipases，PEL)聯(lián)合制備了磁響應(yīng)性復(fù)合酶(magneticresponsive compound lipases，MRCL)，在最優(yōu)工藝條件下得到大豆油轉(zhuǎn)化率為97.87±0.51％，F(xiàn)AMEs得率為98.73±0.51％;與游離PEL和MRL相比，其轉(zhuǎn)化率分別提高了24.20％和