Cytophaga hutchinsonii中纖維素降解相關(guān)突變株的篩選及chu_0602的研究.pdf

1、隨著社會的發(fā)展，人們認識到能源枯竭和環(huán)境污染等問題給人類社會帶來了巨大的挑戰(zhàn)，在這種形勢下可再生綠色能源的開發(fā)和利用技術(shù)就成了應(yīng)對挑戰(zhàn)的有效方法。綠色植物產(chǎn)生的木質(zhì)纖維素被認為是地球上最豐富的可再生資源之一，其開發(fā)和利用有著廣闊的應(yīng)用前景。由于植物的自我保護進化，自然條件下纖維素自身存在著致密的結(jié)晶區(qū)域，使得現(xiàn)有的技術(shù)手段很難像利用纖維素的微生物那樣高效的降解纖維素，因此研究自然條件下微生物利用纖維素的機制非常必要。
　　哈氏噬纖

2、維菌（cytophaga hutchindonii，C.hut）是一種在自然界中有著廣泛分布的好氧革蘭氏陰性菌，它屬于擬桿菌門（Bacteroidetes），其有著與已知能降解纖維素的微生物都不相同的纖維素降解機制，具有極強降解結(jié)晶纖維素能力。哈氏噬纖維菌不依賴于鞭毛或纖毛卻能在濕潤的瓊脂表面和玻璃片表面迅速地運動;哈氏噬纖維菌能夠快速高效的降解纖維素的結(jié)晶區(qū)，但是哈氏噬纖維菌不向胞外分泌游離的纖維素酶，它也沒有明顯的纖維素酶復(fù)合體結(jié)構(gòu)

3、，所以其降解纖維素的機制和運動機制目前都不清楚。在降解纖維素晶體時，哈氏噬纖維菌會有序的排列在其上，因此有報道認為哈氏噬纖維菌的運動有助于它的纖維素的降解，并且這有可能是一種新的纖維素降解機制。
　　為了得到與纖維素降解相關(guān)的基因，我們采用了轉(zhuǎn)座子隨機插入突變的方法來進行人為的誘變。轉(zhuǎn)座子插入突變實驗采用的是Tn4351轉(zhuǎn)座子，其相比較于實驗室曾經(jīng)使用的HimarEm3轉(zhuǎn)座子Tn4351轉(zhuǎn)座子在菌體基因組中很多為多插入位點，因此突

4、變來源更為廣泛。把Tn4351轉(zhuǎn)座子通過電轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)入到C.hut的菌體中，轉(zhuǎn)座子會以隨機插入的方式整合到細菌的基因組上，影響細菌的表型。通過在雙層纖維素驗證平板上接種轉(zhuǎn)化子，根據(jù)轉(zhuǎn)化子在平板上水解纖維素的情況，篩選出與纖維素降解相關(guān)的菌株。然后通過分子水平對突變株鑒定，找到轉(zhuǎn)座子插入基因的位點。由于其已經(jīng)在2007年進行了全基因的測序，結(jié)合生物信息學(xué)綜合判斷確定有價值基因進一步的研究。我們挑取了大約11000個轉(zhuǎn)化子在纖維素雙層平板

5、上，篩選到約180個有明顯表型的菌株，最終選取了36個特殊表型的菌株做了分子學(xué)鑒定，在不同的菌株中共得到了個36基因的插入位點（有些基因被重復(fù)篩選到），其中包括之前報道的chu_0134,chu_0170，chu_1075,chu_1798等重要基因，它們都嚴重影響了細菌的生長和纖維素降解。由于Tn4351轉(zhuǎn)化子在基因組上多為多插入，這樣的好處是能得到更多的插入位點，但在多插入的轉(zhuǎn)化子中不能確定哪一個或者哪幾個基因的改變最終導(dǎo)致了表型的

6、改變，因此對于多插入轉(zhuǎn)化子需要對單個基因逐一敲除研究。對篩選的到的基因做了綜合分析，除去了曾經(jīng)報道過的重要基因，我們先后對一些基因進行了雙交換單獨敲除實驗。
　　在篩選突變株表型的過程中我們注意到除去已經(jīng)報道過的幾個重要基因和一個色素基因缺失的突變株，chu_0602基因缺失的突變株是表型最為明顯突變株之一，其降解纖維素的能力大大下降，之后雙交換敲除工作又成功敲除了chu_0602基因，發(fā)現(xiàn)二者的表型一致，這證明了chu_0602

7、的缺失影響了纖維素的降解。NCBI標注顯示:chu_0602基因編碼的是一個脂質(zhì)A核心-O-抗原連接酶(lipid A core-O-antigen ligase，Wzy_C)，推測其在脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)合成的過程中起到了關(guān)鍵的作用，chu_0602的缺失導(dǎo)致脂多糖部分缺失，進而對生長、纖維素降解、運動以及抗性等的產(chǎn)生多重影響。chu_0602缺失菌株在Stanier纖維素固體培養(yǎng)基和Stanier

8、濾紙培上的纖維素降解能力顯著下降。在軟瓊脂和硬瓊脂上突變株都表現(xiàn)出運動能力的下降。通過光學(xué)和掃描電子顯微鏡(SEM)觀察突變株的菌體，發(fā)現(xiàn)明顯長于野生型菌株，尤其是在延滯期到指數(shù)前期這種現(xiàn)象更為明顯。突變株在濾紙上的排布比野生型菌株混亂，而且突變株的菌體表面更為光滑。生長曲線測量結(jié)果顯示突變株以Avicel為碳源比以葡萄糖為碳源時延滯期增長，生長速率下降。我們檢測了在不同的碳源培養(yǎng)條件下內(nèi)切纖維素酶和β-葡萄糖苷酶活力的分布情況，發(fā)現(xiàn)了

9、脂多糖缺失影響內(nèi)切纖維素酶分布的新現(xiàn)象，脂多糖缺失而對β-葡萄糖苷酶活力的分布沒有明顯影響。在以葡萄糖為唯一碳源時，與野生株相比突變株細胞表面內(nèi)切纖維素酶活明顯下降，表面酶活占全細胞酶活的比例也明顯下降，而胞內(nèi)的纖維素酶活水平和野生株基本相當(dāng)。推測可能由于外膜脂多糖的缺失，影響了纖維素酶在細胞表面的錨定。當(dāng)以Avicel為唯一碳源時，纖維素酶被大量誘導(dǎo)。突變株和野生株相比菌體表面的纖維素酶酶活與野生株基本一致，但是表面纖維素酶占全細胞酶

10、活的比例大大下降。與野生株相比，突變株胞外出現(xiàn)大量纖維素酶累積。推測可能由于外膜脂多糖的缺失影響了纖維素酶在細胞表面的錨定，從而釋放到細胞外環(huán)境中。說明脂多糖與細胞表面纖維素酶的錨定密切相關(guān)。我們還進行了突變株抗逆性實驗，發(fā)現(xiàn)突變株在外界環(huán)境壓力（SDS、抗生素、H2O2、結(jié)晶紫等）下抗性比野生型菌株下降。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示chu_0602突變株外膜蛋白、外膜纖維素吸附蛋白和胞外分泌蛋白跟野生型菌株相比都有較大變化，其中外膜蛋