CHU_1798在Cytophaga hutchinsonii的滑動和纖維素降解中的作用.pdf

1、Cytophagahutchinsonii是一種具有極強降解結晶纖維素能力的纖維素降解細菌，其在自然界中廣泛存在。C.hutchinsonii不依賴于鞭毛或纖毛卻能在玻璃表面迅速運動，其運動機制一直是未解之迷。C.hutchinsonii不分泌游離的纖維素酶也沒有纖維小體結構，卻能夠高效的降解結晶纖維素，其降解機制也不清楚。C.hutchisonii降解結晶纖維素時，菌體有序的排列在纖維素纖維上，因此，研究者認為C.hutchinson

2、ii的運動有助于纖維素的降解。通過對纖維素降解情況的研究，會促進纖維素生物質資源的開發(fā)利用。近幾年，實驗室的遺傳操作體系已經基本建立起來，C.hutchinsoii的相關研究工作已進入到分子水平。本文通過轉座子Tn4351插入突變，尋找影響C.hutchinsoii纖維素降解及滑動的基因，并對發(fā)現的影響C.hutchinsoii滑動的基因CHU_1798進行了功能研究，并以此滑動缺陷菌株，對C.hutchinsoii滑動與纖維素降解之間

3、的關系進行了研究。具體內容與結果如下:
　　1.轉座子Tn4351突變子文庫的構建及滑動相關基因的篩選
　　通過轉座子Tn4351構建C.hutchinsonii突變子文庫，并依據滑動性及纖維素降解能力變化等表型對700株突變子進行篩選，篩選到三株運動能力完全缺失的突變株，通過反向PCR確定了轉座子插入位點，CHU_1798,CHU3693，CHU_3620，并對CHU_1798及CHU_3693兩個基因進行了敲除。

4、　　2.CHU_1798基因的功能研究
　　我們通過轉座子Tn4351插入突變以及基因敲除技術，確認了影響C.hutchinsonii瓊脂表面菌落擴散及單個菌體玻璃表面運動的基因CHU_1798。生物信息學發(fā)現，CHU_1798編碼一個未知功能蛋白，C末端為一個未知功能的結構域CHU_C。Blast比對發(fā)現，與CHU_1798序列相似性大于30％的三個同源蛋白都含有CHU_C結構域，而且這三個蛋白都存在于擬桿菌中，分別是Cytop

5、hagaaurantiaca,Segetibacterkoreensis,NiastellakoreensisGR20-10，這三個菌株含有F.johnsoniae滑動的大部分同源基因。因此，我們認為，CHU_C結構域的蛋白可能參與擬桿菌的運動。F.johnsoniae是研究細菌滑動的模式菌株，至今已有19個滑動相關基因被確定，C.hutchinsonii含有上述所有滑動基因的同源基因，因此研究者認為C.hutchinsonii與F.j

6、ohnsoniae可能具有相同的滑動機制，然而在F.johnsoniae我們并沒有找到CHU_1798的同源蛋白，敲除掉F.johnsoniae中關鍵滑動蛋白SprB的同源蛋白CHU_2225后，菌株并沒有失去滑動能力，而且，C.hutchinsonii表面也未觀察到類似于F.johnsoniae菌體表面纖毛的結構，因此，我們猜測，C.hutchinsonii可能存在一種新的滑動機制。
　　CHU_1798敲除菌株不能在瓊脂表面擴

7、散運動，也失去了單個菌體玻璃表面運動的能力，CHU_1798敲除菌株仍能高效的降解濾紙，液體培養(yǎng)條件下也能高效的降解結晶纖維素AvicelPH101，然而，在纖維素雙層平板實驗中，CHU_1798敲除菌株卻不能降解纖維素，以上結果表明:運動能夠有效的幫助C.hutchinsonii接觸纖維素底物，但是只要菌體在接觸到纖維素的條件下，滑動對纖維素的降解是沒有幫助的。掃描電鏡觀察發(fā)現，菌體在接種初期，敲除株在纖維表面的排列是無序的，然而當菌