Cytophaga hutchinsonii纖維素結(jié)晶區(qū)降解相關(guān)基因chu_3220和chu_1557的研究.pdf

1、纖維素是地球上最豐富的可再生資源，對(duì)纖維素的開發(fā)利用是人類解決資源能源危機(jī)的重要途徑之一。纖維素是由β-D-吡喃葡萄糖單元通過β-1，4-糖苷鍵連接形成的無分支長(zhǎng)鏈，它含有結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)結(jié)構(gòu)。由于纖維素大分子間、纖維素大分子內(nèi)部以及纖維素和水分子問氫鍵的存在，纖維素的結(jié)晶區(qū)結(jié)構(gòu)難以被降解。纖維素結(jié)晶區(qū)的破壞被認(rèn)為是纖維素利用的第一步和限速的關(guān)鍵步驟。微生物對(duì)纖維素的降解和轉(zhuǎn)化是自然界碳循環(huán)的主要環(huán)節(jié)，并形成了不同的纖維素降解策略。目前

2、，有兩種研究得較清楚的纖維素降解機(jī)制:游離纖維素酶機(jī)制和纖維小體機(jī)制。多數(shù)的好氧纖維素降解微生物降解纖維素通過游離纖維素酶機(jī)制，其中很多的纖維素酶含有碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域(carbohydrate bindingmolecule，CBM)。多數(shù)的厭氧微生物降解纖維素通過纖維小體機(jī)制，每個(gè)纖維小體都含有一個(gè)支架蛋白，而每個(gè)支架蛋白上都有一個(gè)CBM結(jié)構(gòu)域。CBM結(jié)構(gòu)能夠結(jié)合并增溶結(jié)晶纖維素，起到破壞纖維素結(jié)晶區(qū)的作用。除了CBM外，已發(fā)現(xiàn)的

3、能夠破壞纖維素結(jié)晶區(qū)的蛋白還有expansins，expansin-like protein，swollenins, lytic polysaccharide monooxygenases(LPMOs)等。
　　Cytophaga hutchinsonii是一種廣泛分布于土壤中的革蘭氏陰性細(xì)菌，能夠高效地降解結(jié)晶纖維素，如濾紙和棉纖維等。分析C.hutchinsonii的基因組序列發(fā)現(xiàn)它沒有外切纖維素酶，并且內(nèi)切纖維素酶都不含CB

4、M結(jié)構(gòu)。C.hutchinsonii降解纖維索需要與纖維素底物直接接觸，且大多數(shù)的纖維索酶活都是細(xì)胞偶聯(lián)的?；蚪M分析顯示它也不含有編碼纖維小體特征的錨定(dockerin)或粘附(cohesion)結(jié)構(gòu)域。因此，C.hutchinsonii可能采用一種全新的且未知的纖維素降解機(jī)制，其小同于已知的游離纖維素酶機(jī)制和纖維小體機(jī)制。C.hutchinsonii能夠利用葡萄糖、纖維寡糖和纖維素作為底物生長(zhǎng)，然而，在以纖維素為唯一碳源生長(zhǎng)時(shí)在其

5、培養(yǎng)基上清中未檢測(cè)到還原糖產(chǎn)物的積累。推測(cè)C.hutchinsonii可能的纖維素降解機(jī)制:在它的細(xì)胞表面可能存在一個(gè)蛋白復(fù)合體能夠?qū)蝹€(gè)的纖維素鏈從纖維素上剝離并轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)空問，在周質(zhì)空問中纖維素鏈被纖維素酶降解。C.hutchinsonii能夠降解結(jié)晶纖維素，然而，除了CBM，它也不含有expansins，expansin-like protein，swollenins和LPMOs等能夠破壞纖維素結(jié)晶區(qū)的蛋白，其破壞纖維素結(jié)晶區(qū)結(jié)構(gòu)

6、的機(jī)制未知。
　　近幾年，隨著C.hutchinsonii遺傳操作技術(shù)的不斷發(fā)展，其纖維素降解機(jī)制的研究有了一定的進(jìn)展。本文首先嘗試了對(duì)C.hutchinsonii遺傳操作技術(shù)的改進(jìn)，獲得了一種基于FLP/FRT重組系統(tǒng)的外源DNA插入整合到基因組特定位點(diǎn)上的方法;同時(shí)，利用轉(zhuǎn)座子插入突變方法篩選到2個(gè)參與C.hutchinsonii纖維素降解的關(guān)鍵基因，并分別對(duì)其基因功能進(jìn)行了深入研究。在此基礎(chǔ)上，也探討了C.hutchinso

7、nii降解纖維素結(jié)晶區(qū)的影響因素。這些工作對(duì)揭示C.hutchinsonii獨(dú)特的纖維素降解機(jī)制有重要的意義。具體內(nèi)容如下:
　　1.建立了一種基于FLP/FRT重組系統(tǒng)的外源DNA插入整合技術(shù)
　　目前，在C.hutchinsonii中表達(dá)外源基因常用質(zhì)粒作為載體，然而質(zhì)粒存在不穩(wěn)定、需要添加抗生素維持其存在等缺點(diǎn)。前期，實(shí)驗(yàn)室也利用線性DNA雙交換同源重組的方法成功地將外源DNA片段整合到C.hutchinsonii的基

8、因組上，但是較長(zhǎng)的同源片段限制了外源DNA片段的大小，不利于大片段DNA的整合。來源于Saccharomyces cerevisiae的FLP/FRT位點(diǎn)專一性重組系統(tǒng)是最有效的遺傳工具之一，廣泛應(yīng)用于基因敲除、基因重組等領(lǐng)域。實(shí)驗(yàn)室前期成功地將FLP/FRT重組系統(tǒng)改造應(yīng)用于C.hutchinsonii中，實(shí)現(xiàn)了基因的無標(biāo)記敲除。
　　本文利用FLP重組酶可以識(shí)別基因組上的和環(huán)形片段上的FRT位點(diǎn)，使得環(huán)形片段整合到基因組上的特

9、點(diǎn)，建立了一種可以將外源DNA片段插入整合到C.hutchinsonii基因組上的技術(shù)。首先，我們?cè)贑.hutchinsonii的一個(gè)假基因(chu_3328)位置插入一個(gè)FRT位點(diǎn)，構(gòu)建了一個(gè)含有單一FRT位點(diǎn)的出發(fā)菌株。同時(shí)也構(gòu)建了一個(gè)含有單一FRT位點(diǎn)的自殺質(zhì)粒，通過FLP重組酶的作用可以將自殺質(zhì)粒整合到chu3328位置。我們用此方法成功地將lacZ基因整合到了C.hutchinsonii基因組上并表達(dá)。此方法將外源 DNA片段

10、整合到C.hutchinsonii的基因組的特定位點(diǎn)，不需要額外添加抗生素維持其穩(wěn)定，遺傳背景清晰明確;僅需要FRT位點(diǎn)的存在就可以完成整合，不需要較長(zhǎng)同源臂的存在。實(shí)驗(yàn)室前期建立的基于FLP/FRT重組系統(tǒng)的無標(biāo)記敲除技術(shù)在敲除目的基因后會(huì)存在一個(gè)FRT位點(diǎn)，而我們也可以利用此FRT位點(diǎn)成功實(shí)現(xiàn)基因的原位回補(bǔ)，此方法比質(zhì)粒回補(bǔ)或雙交換回補(bǔ)操作更簡(jiǎn)單，結(jié)果更穩(wěn)定。
　　2.chu3220基因功能研究
　　C.hutchins

11、onii基因組含有3790個(gè)開放閱讀框，其中僅1986個(gè)通過預(yù)測(cè)進(jìn)行了功能注釋。前期，實(shí)驗(yàn)室建立了轉(zhuǎn)座子插入突變的方法篩選與纖維素降解相關(guān)的基因。我們利用轉(zhuǎn)座子HimarEm3插入突變的方法篩選到一株纖維素降解缺陷菌株。反向PCR確定轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)為chu3220。敲除chu3220后獲得突變株Δ3220，驗(yàn)證其纖維素降解表型與插入突變?nèi)毕菥暌恢?。RT-PCR顯示Δ3220中chu3220的臨近基因的轉(zhuǎn)錄未受到chu3220敲除的影響

12、，說明chu3220是結(jié)晶纖維素降解的關(guān)鍵基因。
　　分析△3220在不同碳源中的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)突變株在葡萄糖、纖維二糖和無定型纖維素中生長(zhǎng)速率和最大生物量都不低于野生型，但是在Avicel中的生長(zhǎng)速率和最大生物量都明顯低于野生型，說明了chu3220的缺失影響C.hutchinsonii對(duì)纖維素結(jié)晶區(qū)的降解。X光衍射（X-ray diffraction， XRD）檢測(cè)Avicel的結(jié)晶度發(fā)現(xiàn)野生型處理后的Avicel結(jié)晶度降低，

13、而突變株處理后的Avicel結(jié)晶度升高。掃面電子顯微鏡(SEM)檢測(cè)Avicel表面形態(tài)，發(fā)現(xiàn)Avicel表面粗糙不規(guī)則，而野生型處理后的Avicel表面光滑整齊，推測(cè)C.hutchinsonii通過一種“剝皮”方式降解纖維素的結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)。觀察突變株處理后的Avicel表面時(shí)發(fā)現(xiàn)它和未處理的Avicel表面類似，都比較的粗糙且不規(guī)則。通過檢測(cè)突變株的生長(zhǎng)、Avicel結(jié)晶度變化和表面形態(tài)變化說明了chu3220是C.hutchin

14、sonii降解纖維素結(jié)晶區(qū)的關(guān)鍵基因。
　　CHU_3220的分子量為205 kDa，是一個(gè)未知功能蛋白，含有一個(gè)CHU_C結(jié)構(gòu)域和15個(gè)PbH l結(jié)構(gòu)域。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CHU_3220的CHU C結(jié)構(gòu)與其蛋白定位相火，而 PbHl推測(cè)與蛋白的相互作用相關(guān)。CHU_3220定位于細(xì)胞外表面，是一個(gè)纖維素結(jié)合蛋白，其表達(dá)水平受到纖維素的誘導(dǎo)。chu3220敲除后突變株的細(xì)胞表面內(nèi)切纖維素酶酶活明顯降低，然而，這些內(nèi)切纖維素酶的轉(zhuǎn)錄水平也明

15、顯的降低。CHU_3220與已知的纖維小體的支架蛋白有很多的相似性，但并未找到CHU_3220與內(nèi)切纖維素酶相互作用的證據(jù)。綜合以上結(jié)果，我們推測(cè)CHU_3220可能是C.hutchinsonii細(xì)胞表面的蛋白復(fù)合體的組成成分，起到剝離單個(gè)纖維素鏈，破壞纖維素結(jié)晶區(qū)的作用。
　　同時(shí)，本文也使用了離子色譜檢測(cè)C.hutchinsonii的纖維素降解產(chǎn)物。野生型在Avicel中培養(yǎng)5h后，檢測(cè)其培養(yǎng)基上清發(fā)現(xiàn)了葡萄糖、纖維二糖和纖維

16、三糖，說明C.hutchinsonii細(xì)胞表面的纖維素酶能夠部分降解纖維素。然而，隨著時(shí)問延長(zhǎng)，培養(yǎng)基中的還原糖逐漸減少，在24 h時(shí)檢測(cè)不到還原糖的存在。同時(shí)，我們也檢測(cè)了C.hutchinsonii在24 h時(shí)的胞內(nèi)還原糖，發(fā)現(xiàn)了葡萄糖、纖維二糖、纖維三糖和纖維四糖的存在，說明了C.hutchinsonii能夠?qū)⒗w維寡糖轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)空間進(jìn)行降解。檢測(cè)突變株的胞內(nèi)還原糖時(shí)也發(fā)現(xiàn)了纖維寡糖的存在，說明了CHU_3220的缺失不影響纖維寡糖

17、的轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　除了破壞纖維素氫鍵相關(guān)的蛋白外，C.hutchinsonii破壞纖維素結(jié)晶區(qū)結(jié)構(gòu)還需要ATP的供應(yīng)和完整細(xì)胞結(jié)構(gòu)的存在。在培養(yǎng)基中添加NaN3后，C.hutchinsonii不能降解結(jié)晶纖維素，但是能夠降解無定型纖維素，說明結(jié)晶區(qū)的破壞需要能量。TritonX-100能夠破壞細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)，但不影響蛋白間的相互作用。使用Triton X-100處理C.hutchinsonii細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)其處理后的纖維素結(jié)晶度升高，說明纖

18、維素的無定型區(qū)被降解。與已知的纖維素結(jié)晶區(qū)利用方式不同，C.hutchinsonii降解纖維素結(jié)晶區(qū)不僅依靠參與纖維素結(jié)晶區(qū)破壞的相關(guān)蛋白，還需要完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和能量的供應(yīng)。
　　3.chu_1557基因功能研究
　　chu_1557是通過HimarEm3轉(zhuǎn)座子篩選到的另一個(gè)影響C.hutchinsonii纖維素降解相關(guān)的基因。chu_1557基因定點(diǎn)敲除(Δ1557)后，RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)chu_1557的缺失未影響前后

19、基因的轉(zhuǎn)錄。CHU_1557的分了量為391.4kDa，是一個(gè)未知功能蛋白，含有一個(gè)N-端信號(hào)肽和C-端保守結(jié)構(gòu)域(C-terminaldomain，CTD)，可能通過Ⅸ型分泌系統(tǒng)(typeⅨ secretion system.T9SS)穿越外膜并錨定于細(xì)胞外膜的A-LPS上。通過Western blot定位CHU_1557，發(fā)現(xiàn)其位于細(xì)胞外膜的外表面，且是一個(gè)纖維索結(jié)合蛋白。檢測(cè)野生型在葡萄糖培養(yǎng)條件下的chu_1557表達(dá)水平變化，

20、發(fā)現(xiàn)chu_1557在延滯期表達(dá)水平明顯上調(diào)，而在對(duì)數(shù)期表達(dá)水平下降，說明chu1557可能與C.hutchinsonii的啟動(dòng)生長(zhǎng)相關(guān)。而在纖維素培養(yǎng)條件下，其對(duì)數(shù)期表達(dá)水平仍然上調(diào)，說明其與纖維素降解密切相關(guān)。
　　檢測(cè)△1557的生長(zhǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)突變株的延滯期與葡萄糖濃度相關(guān)。在高濃度葡萄糖(0.4％，w/v)培養(yǎng)條件下突變株的延滯期和野生型相差不大，而在低濃度葡萄糖(0.1％，w/v)培養(yǎng)條件下突變株的延滯期比野生型長(zhǎng)60 h。

21、將突變株分別用不同的葡萄糖濃度培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)隨著葡萄糖濃度的升高，突變株的延滯期降低，在達(dá)到0.4％(w/v)時(shí)突變株的延滯期最短。同時(shí)，將低濃度葡萄糖培養(yǎng)后的突變株再接種到低濃度葡萄糖條件下培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)突變株的延滯期明顯縮短。在以無定型纖維素和結(jié)晶纖維素為碳源的培養(yǎng)基中，突變株的延滯期比野生型長(zhǎng)約72 h，而低濃度葡萄糖預(yù)培養(yǎng)的突變株其延滯期也明顯縮短，和野生型相差不大。低濃度和高濃度葡萄糖預(yù)培養(yǎng)的突變株在結(jié)晶纖維素中的最大生物量分別為野生

22、型的33％和62％，說明突變株能夠利用部分的結(jié)晶纖維素。
　　檢測(cè)突變株的葡萄糖吸收情況時(shí)發(fā)現(xiàn)CHU_1557影響C.hutchinsonii對(duì)低濃度葡萄糖的吸收，但不影響對(duì)高濃度葡萄糖的吸收，且低濃度預(yù)培養(yǎng)的突變株其對(duì)低濃度葡萄糖的吸收速率與野生型相似。纖維素結(jié)晶區(qū)的破壞需要能量，CHU_1557的缺失導(dǎo)致葡萄糖的吸收速率降低，影響了突變株破壞纖維素結(jié)晶區(qū)的能量供應(yīng)。檢測(cè)突變株的胞內(nèi)ATP水平時(shí)發(fā)現(xiàn)明顯少于野生型的，而在測(cè)定其A

23、TP合成酶組分的轉(zhuǎn)錄水平時(shí)發(fā)現(xiàn)均無下降，說明了CHU_1557的缺失導(dǎo)致突變株需要更多的能量供其生長(zhǎng)。由此推測(cè)CHU1557的兩方面作用:一是影響了胞外低濃度葡萄糖的吸收，導(dǎo)致合成的ATP減少;二是CHU_1557作為細(xì)胞表面蛋白復(fù)合體的組分消耗能量參與破壞纖維素結(jié)晶區(qū)的降解，突變株的生長(zhǎng)需要消耗更多的ATP，導(dǎo)致突變株胞內(nèi)ATP水平明顯小于野生型。突變株因無充足的能量供應(yīng)導(dǎo)致其降解結(jié)晶纖維素效率降低，而在提供更多的能量如添加葡萄糖或低

24、濃度葡萄糖預(yù)培養(yǎng)時(shí)會(huì)有助于突變株降解結(jié)晶纖維素。
　　本文首先在C.hutchinsonii中建立了基于FLP/FRT重紕系統(tǒng)的外源DNA插入整合技術(shù)，此方法消除了質(zhì)粒遺傳不穩(wěn)定性的特點(diǎn)，且能夠利用基于FLP/FRT重組系統(tǒng)構(gòu)建的無痕敲除所產(chǎn)生的的單一FRT位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)敲除基因的原位回補(bǔ)和目的基因的表達(dá)。C.hutchinsonii能夠高效地降解結(jié)晶纖維素，但是具體機(jī)制并不清楚。本文通過分析胞內(nèi)和胞外的纖維素水解產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)C.hutc

25、hinsonii能夠通過胞內(nèi)降解和細(xì)胞表面降解兩條途徑降解纖維素。纖維素結(jié)晶區(qū)的破壞是纖維素降解的限速步驟，本文通過插入突變的方法首次篩選到兩個(gè)影響纖維素結(jié)晶區(qū)降解的關(guān)鍵基因chu_3220和chu_1557。研究發(fā)現(xiàn)CHU_3220和CHU_1557可能是細(xì)胞表而的蛋白復(fù)合體的重要組分，而此蛋白復(fù)合體可能負(fù)責(zé)纖維素結(jié)晶區(qū)纖維素鏈的剝離。我們發(fā)現(xiàn)纖維素結(jié)晶區(qū)的破壞除需要結(jié)晶區(qū)降解相關(guān)蛋白參與外，還需要完整的活細(xì)胞提供能量。C.hutch