Cytophaga hutchinsonii中結(jié)晶纖維素降解相關(guān)基因功能的研究.pdf

1、現(xiàn)代經(jīng)濟的發(fā)展依賴于化石資源如石油、煤炭、天然氣等的開發(fā)。而這類資源為不可再生資源，已面臨短缺?？稍偕Y源的開發(fā)利用日益引起各國政府的重視。作為可再生資源的重要組成部分，生物質(zhì)資源有著其他資源不可替代的優(yōu)勢。纖維素是地球上含量最為豐富的一類生物質(zhì)資源。以其為原料生產(chǎn)燃料乙醇被認為是燃料乙醇產(chǎn)業(yè)的重要發(fā)展方向之一。但是由于目前纖維素轉(zhuǎn)化效率低、成本高等因素，燃料乙醇目前和石油依然無法競爭。 哈氏噬纖維菌（Cytophaga hut

2、chinsonii）是自然界中廣泛存在的可徹底降解結(jié)晶纖維素一類好氧細菌。其在降解纖維素方面有著降解徹底，降解速度快等特點。但是目前的研究表明其降解纖維素的機制與眾不同，因此C． hutchinsonii被美國能源部列入其基因組計劃，并于2005年完成其4MB的全基因組測序工作。本文擬在此基礎上開展相關(guān)工作，對纖維素降解相關(guān)基因的功能進行初步的探討，為進一步揭示其纖維素降解機制打下基礎。 本文從GenBank中獲得C． hutc

3、hinsonii中與結(jié)晶纖維素降解相關(guān)基因，運用多種生物信息學軟件如TMHMM、SingalP、SMART等分析序列的相關(guān)信息。通過分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)切纖維素酶基因的催化結(jié)構(gòu)域集中于GH9和GH5家族，而β-葡萄糖苷酶則大都屬于GH3家族。其中CHU1335有著特殊的結(jié)構(gòu)。它由一個GH9家族催化結(jié)構(gòu)域和一個推測為β折疊桶的結(jié)構(gòu)組成。從它的結(jié)構(gòu)上我們推測，這個蛋白可能在膜上形成一個通道，在纖維素降解中起到重要的作用。同時發(fā)現(xiàn)這些內(nèi)切纖維素酶基因

4、中大多缺少常見的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBM），推測其與纖維素結(jié)合的方式是特殊的。 本文利用實時熒光定量PCR（RQ-PCR）技術(shù)檢測C．hutchinsonii在不同培養(yǎng)條件下各纖維素酶基因的表達差異。通過檢測發(fā)現(xiàn)，以有機質(zhì)為培養(yǎng)基，不同碳源（葡萄糖和纖維素）培養(yǎng)情況下，除CHU1336，其他幾個檢測的基因差異都不大。而以無機鹽為培養(yǎng)基，不同碳源培養(yǎng)情況下，各基因轉(zhuǎn)錄情況相近。結(jié)果說明，C． hutchinsonii中檢測的這幾個

5、纖維素降解基因在轉(zhuǎn)錄水平上差異不大，可能存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。 本文以自殺質(zhì)粒pLYL03為載體，將待敲除基因同源片段通過酶切連接與其連接，然后將構(gòu)建好的載體通過E．coli的接合能力轉(zhuǎn)化入C． hutchinsonii中，讓其依靠同源重組將載體插入待敲除基因中，達到中斷基因的作用。目前采用多種策略構(gòu)建好多個含同源片段的基因敲除質(zhì)粒。但在將其轉(zhuǎn)化進C．hutchinsonii過程中碰到不少困難，目前已獲得一個CHU1335的敲除突變子

6、，對其驗證的工作正在進行。基因敲除困難的主要原因是接合轉(zhuǎn)化的效率太低，考慮到這一點，我們也嘗試了電轉(zhuǎn)化的方法。 本文比較了C．hutchinsonii在葡萄糖、纖維二糖、微晶纖維素、磷酸膨脹纖維素為碳源情況下生長和產(chǎn)酶的差異。通過比較發(fā)現(xiàn)，在以葡萄糖或纖維二糖為碳源時，C．hutchinsonii生長幾乎無延遲期，C．hutchinsonii胞外基本檢測不到酶活，且在碳源耗盡后，其OD也會迅速降低，推測是菌體自溶造成的結(jié)果。微晶

7、纖維素或磷酸膨脹纖維素培養(yǎng)情況下，菌體的生長量明顯低于可溶性碳源為底物的培養(yǎng)條件，胞外都可檢測到較高的內(nèi)切纖維素酶活，且磷酸膨脹纖維素條件下的產(chǎn)酶是微晶纖維素的3倍左右。研究表明纖維素底物對C．hutchinsonii的纖維素酶產(chǎn)生有明顯的誘導作用。同時我們發(fā)現(xiàn)C．hutchinsonii在以磷酸膨脹纖維素為碳源時胞外可累積還原糖。這是首次發(fā)現(xiàn)該菌生長過程中積累胞外還原糖的現(xiàn)象。 通過這些對Cytophaga hutchinso