Cytophaga hutchinsonii中結(jié)晶纖維素降解相關(guān)基因功能的研究.pdf

1、現(xiàn)代經(jīng)濟(jì)的發(fā)展依賴(lài)于化石資源如石油、煤炭、天然氣等的開(kāi)發(fā)。而這類(lèi)資源為不可再生資源，已面臨短缺?？稍偕Y源的開(kāi)發(fā)利用日益引起各國(guó)政府的重視。作為可再生資源的重要組成部分，生物質(zhì)資源有著其他資源不可替代的優(yōu)勢(shì)。纖維素是地球上含量最為豐富的一類(lèi)生物質(zhì)資源。以其為原料生產(chǎn)燃料乙醇被認(rèn)為是燃料乙醇產(chǎn)業(yè)的重要發(fā)展方向之一。但是由于目前纖維素轉(zhuǎn)化效率低、成本高等因素，燃料乙醇目前和石油依然無(wú)法競(jìng)爭(zhēng)。 哈氏噬纖維菌（Cytophaga hut

2、chinsonii）是自然界中廣泛存在的可徹底降解結(jié)晶纖維素一類(lèi)好氧細(xì)菌。其在降解纖維素方面有著降解徹底，降解速度快等特點(diǎn)。但是目前的研究表明其降解纖維素的機(jī)制與眾不同，因此C． hutchinsonii被美國(guó)能源部列入其基因組計(jì)劃，并于2005年完成其4MB的全基因組測(cè)序工作。本文擬在此基礎(chǔ)上開(kāi)展相關(guān)工作，對(duì)纖維素降解相關(guān)基因的功能進(jìn)行初步的探討，為進(jìn)一步揭示其纖維素降解機(jī)制打下基礎(chǔ)。 本文從GenBank中獲得C． hutc

3、hinsonii中與結(jié)晶纖維素降解相關(guān)基因，運(yùn)用多種生物信息學(xué)軟件如TMHMM、SingalP、SMART等分析序列的相關(guān)信息。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，內(nèi)切纖維素酶基因的催化結(jié)構(gòu)域集中于GH9和GH5家族，而β-葡萄糖苷酶則大都屬于GH3家族。其中CHU1335有著特殊的結(jié)構(gòu)。它由一個(gè)GH9家族催化結(jié)構(gòu)域和一個(gè)推測(cè)為β折疊桶的結(jié)構(gòu)組成。從它的結(jié)構(gòu)上我們推測(cè)，這個(gè)蛋白可能在膜上形成一個(gè)通道，在纖維素降解中起到重要的作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)這些內(nèi)切纖維素酶基因

4、中大多缺少常見(jiàn)的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBM），推測(cè)其與纖維素結(jié)合的方式是特殊的。 本文利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RQ-PCR）技術(shù)檢測(cè)C．hutchinsonii在不同培養(yǎng)條件下各纖維素酶基因的表達(dá)差異。通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，以有機(jī)質(zhì)為培養(yǎng)基，不同碳源（葡萄糖和纖維素）培養(yǎng)情況下，除CHU1336，其他幾個(gè)檢測(cè)的基因差異都不大。而以無(wú)機(jī)鹽為培養(yǎng)基，不同碳源培養(yǎng)情況下，各基因轉(zhuǎn)錄情況相近。結(jié)果說(shuō)明，C． hutchinsonii中檢測(cè)的這幾個(gè)

5、纖維素降解基因在轉(zhuǎn)錄水平上差異不大，可能存在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。 本文以自殺質(zhì)粒pLYL03為載體，將待敲除基因同源片段通過(guò)酶切連接與其連接，然后將構(gòu)建好的載體通過(guò)E．coli的接合能力轉(zhuǎn)化入C． hutchinsonii中，讓其依靠同源重組將載體插入待敲除基因中，達(dá)到中斷基因的作用。目前采用多種策略構(gòu)建好多個(gè)含同源片段的基因敲除質(zhì)粒。但在將其轉(zhuǎn)化進(jìn)C．hutchinsonii過(guò)程中碰到不少困難，目前已獲得一個(gè)CHU1335的敲除突變子

6、，對(duì)其驗(yàn)證的工作正在進(jìn)行。基因敲除困難的主要原因是接合轉(zhuǎn)化的效率太低，考慮到這一點(diǎn)，我們也嘗試了電轉(zhuǎn)化的方法。 本文比較了C．hutchinsonii在葡萄糖、纖維二糖、微晶纖維素、磷酸膨脹纖維素為碳源情況下生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的差異。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，在以葡萄糖或纖維二糖為碳源時(shí)，C．hutchinsonii生長(zhǎng)幾乎無(wú)延遲期，C．hutchinsonii胞外基本檢測(cè)不到酶活，且在碳源耗盡后，其OD也會(huì)迅速降低，推測(cè)是菌體自溶造成的結(jié)果。微晶

7、纖維素或磷酸膨脹纖維素培養(yǎng)情況下，菌體的生長(zhǎng)量明顯低于可溶性碳源為底物的培養(yǎng)條件，胞外都可檢測(cè)到較高的內(nèi)切纖維素酶活，且磷酸膨脹纖維素條件下的產(chǎn)酶是微晶纖維素的3倍左右。研究表明纖維素底物對(duì)C．hutchinsonii的纖維素酶產(chǎn)生有明顯的誘導(dǎo)作用。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)C．hutchinsonii在以磷酸膨脹纖維素為碳源時(shí)胞外可累積還原糖。這是首次發(fā)現(xiàn)該菌生長(zhǎng)過(guò)程中積累胞外還原糖的現(xiàn)象。 通過(guò)這些對(duì)Cytophaga hutchinso