Cytophaga hutchinsonii遺傳操作體系的構(gòu)建及纖維素利用缺陷菌的篩選與鑒定.pdf

1、當(dāng)今社會，能源和環(huán)境是全世界、全人類共同關(guān)心的問題，也是我國社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要問題。然而隨著石油、煤炭等非可再生資源的逐漸枯竭，開發(fā)新的可再生能源已經(jīng)成為人們迫切的需求。纖維素類能源植物是頗具前景的生物質(zhì)原料，這類植物多為多年生植物，生長迅速、生物質(zhì)產(chǎn)量大且適應(yīng)能力強(qiáng)，但是纖維素的酶解效率低使得纖維素類生物質(zhì)能源走出實驗室，實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化目標(biāo)存在許多障礙。隨著多種纖維素降解微生物及其酶類的發(fā)現(xiàn)，人們對纖維素降解機(jī)理有了更加理性的認(rèn)識，為實現(xiàn)

2、廉價高效開發(fā)生物質(zhì)資源奠定了理論基礎(chǔ)。
　　 Cytophaga hutchinsonii廣泛存在于自然界中，它對結(jié)晶纖維素降解速度快，分解能力強(qiáng)，因此，對其纖維素降解機(jī)制的闡明，將對人們深入了解微生物降解纖維素機(jī)制的多樣性有重要的理論意義。自從1938年Walker和Warren分離C.hutchinsonii以來，對該菌纖維素降解機(jī)理的研究只停留在生理生化水平上，并未有太多相關(guān)的報道。限制該菌研究的主要因素主要有兩方面:第一

3、，對該菌纖維素降解相關(guān)酶的異源表達(dá)存在很大難度;第二，缺乏成熟且穩(wěn)定的遺傳操作系統(tǒng)。本論文以C.hutchinsonii為研究對象，建立完善了以電轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)的遺傳操作體系，并利用轉(zhuǎn)座子誘變技術(shù)獲得了一株纖維素利用缺陷突變株，進(jìn)一步鑒定了所插入失活的基因座位;通過熒光定量PCR方法，分析了其纖維素酶在不同碳源下的表達(dá)情況，具體工作內(nèi)容和研究結(jié)果如下:
　　 1.C.hutchinsonii生長狀態(tài)的研究及遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立。

4、>　　 對C.hutchinsonii進(jìn)行培養(yǎng)主要有PYG培養(yǎng)基和無機(jī)鹽培養(yǎng)基，通過調(diào)節(jié)其中的碳源和氮源比例使其生長到穩(wěn)定期時的OD600值達(dá)到原來培養(yǎng)基培養(yǎng)時的2-5倍，從而為遺傳轉(zhuǎn)化的進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)。C.hutchinsonii的遺傳操作體系尚未成熟，遺傳轉(zhuǎn)化是限制其遺傳操作的關(guān)鍵因素，制約著C.hutchinsonii對外源基因的整合、基因功能鑒定和代謝機(jī)制的研究。本研究中探索了多種遺傳轉(zhuǎn)化方法，最終確定以電轉(zhuǎn)化方法將外源基因轉(zhuǎn)

5、入C.hutchinsonii中的轉(zhuǎn)化途徑和方法，并確定了電轉(zhuǎn)化的最佳條件，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1×103-104colonies/μgDNA。
　　 2.C.hutchinsonii中纖維素酶在不同碳源培養(yǎng)條件下表達(dá)情況存在差異。
　　 C.hutchinsonii中有多個被注釋為與纖維素降解相關(guān)的基因，通過在轉(zhuǎn)錄水平上分析它們在不同底物下的表達(dá)情況，從而推斷其與纖維素降解的關(guān)系。結(jié)合反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)和熒光定量PC

6、R技術(shù)對其中10個纖維素酶基因在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)chu-1107，chu-1280，chu-1335，chu-1655，chu-2268這五個基因可以被纖維素誘導(dǎo)表達(dá)，且它們的誘導(dǎo)表達(dá)模式不同，為以后用生化方法研究纖維素酶誘導(dǎo)表達(dá)模式奠定了基礎(chǔ)。
　　 3.通過轉(zhuǎn)座子pHimarEM1隨機(jī)誘變C.hutchinsonii篩選獲得一株纖維素利用缺陷的突變株。
　　 利用轉(zhuǎn)座子pHimarEM1誘變篩選不能

7、利用纖維素作為碳源進(jìn)行生長的隨機(jī)突變株。經(jīng)過篩選，得到了一株纖維素利用缺陷的菌株，命名為C-34菌株。通過質(zhì)粒拯救并測序的方法確定轉(zhuǎn)座子插入位置為基因座位chu-1278。C-34菌株在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，與野生型菌株生長狀況差異不大，但是在以纖維素作為碳源的培養(yǎng)基中有明顯的生長缺陷。對突變株進(jìn)行基因回補(bǔ)實驗后恢復(fù)野生型表型，說明基因chu-1278在C.hutchinsonii降解纖維素過程中有重要作用。
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8、.C.hutchinsonii中滑動相關(guān)基因的研究及基因敲除方法的探索。
　　 C.hutchinsonii可以在固體介質(zhì)表面滑動，其滑動性與纖維素降解之間可能有重要聯(lián)系。C.hutchinsonii的運動機(jī)制尚不明確，我們將C.hutchinsonii中可能與其滑動相關(guān)的基因進(jìn)行了整理，并試圖用單插入失活，同源雙交換敲除，Cre-loxP等方法對其中部分基因進(jìn)行敲除，但沒有得到預(yù)期的突變株。在此過程中多個載體的構(gòu)建和敲除方法的