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1、硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)屬于糖胺聚糖(glycosaminoglycans,GAGs)家族,抗凝藥物肝素(heparin,HP)為HS的特殊形式。HS廣泛存在于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞表面和細(xì)胞外基質(zhì),通過與核心蛋白的絲氨酸/蘇氨酸殘基共價(jià)結(jié)合形成硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(Heparan sulfate proteoglycan,HSPG)。微觀結(jié)構(gòu)高度不均一的HS可與大量不同的肝素結(jié)合蛋白(heparin binding
2、 proteins,HBPs)相互作用,參與或調(diào)節(jié)凝血、炎癥反應(yīng)、病原微生物感染、細(xì)胞增殖分化等諸多生物過程,因此,結(jié)構(gòu)確定的HS寡糖是新型創(chuàng)新藥物的重要先導(dǎo)化合物。由于HS結(jié)構(gòu)的高度復(fù)雜性,化學(xué)法合成HS/HP寡糖面臨反應(yīng)步數(shù)多、合成效率低等挑戰(zhàn)。美國(guó)北卡大學(xué)教堂山分校的劉建(Jian Liu)教授通過模擬HS/HP的生物合成過程發(fā)展了一種全新的化學(xué)酶法合成技術(shù),被認(rèn)為是當(dāng)前高效合成多樣化HS寡糖的理想策略。因此,本課題首先利用酶法制
3、備得至到了合成所必需的糖基供體尿苷二磷酸N-(三氟)乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc/TFA)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcAc)以及硫酸基供體腺苷3'-磷酸5'-磷酰硫酸(PAPS);重點(diǎn)利用化學(xué)酶法合成了結(jié)構(gòu)確定的不同HS骨架寡糖以及N-硫酸化、和6-O-硫酸化的HS寡糖;最后建立了HS寡糖的高效液相色譜-電霧式檢測(cè)-質(zhì)譜(HPLC-CAD-MS)聯(lián)用分析方法。本論文取得的主要研究成果如下:
1.糖基供體的酶法
4、合成及規(guī)?;苽?br> 以N-乙酰氨基葡萄(GlcNAc)(或N-三氟乙酰氨基葡萄,GlcNTFA)為原料,經(jīng)大腸桿菌表達(dá)的N-乙酰氨基葡萄1-激酶(NahK)、N-乙酰氨基葡萄尿苷轉(zhuǎn)移酶(GlmU)和無機(jī)焦磷酸化酶(PPA)共同催化一步合成了UDP-GlcNAc或UDP-GlcNTFA;以尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)為原料,經(jīng)牛肝UDP-Glc脫氫酶(UDP-Glc DH)和L-乳酸脫氫酶(LDH)雙酶催化合成UDP-Glc
5、A;用強(qiáng)陰離子交換柱層析純化得到單一化合物,HPLC-多氨柱(PAMN)鑒定純度>95%,三種糖基供體制備規(guī)模達(dá)到克級(jí)。
2.硫酸基供體的酶法合成及規(guī)?;苽?br> 以三磷酸腺苷(ATP)及硫酸根離子為原料,在大腸桿菌共表達(dá)的ATP硫酸化酶-APS激酶(KAST-APSK)及PPA共同催化下一步合成PAPS;用強(qiáng)陰離子交換柱層析純化得到PAPS,PAMN-HPLC鑒定純度>90%,制備規(guī)模達(dá)到克級(jí)。
3.HS骨架
6、寡糖的酶法合成與結(jié)構(gòu)表征
以帶UV標(biāo)簽的4-對(duì)硝基苯葡萄糖醛酸(GlcA-pnp)為起始原料,在N-乙酰氨基葡萄轉(zhuǎn)移酶(KfiA)的催化下,以UDP-GlcNAc(或UDP-GlcNTFA)為糖基供體,向其非還端添加GlcNAc(或GlcNTFA),用PAMN-HPLC檢測(cè)確定反應(yīng)終點(diǎn)(產(chǎn)率>95%),用C18填料純化得到二糖;然后在Pasteurella multocida heparosan合成酶PmHS2的催化下,以UD
7、P-GlcA為糖基供體,向二糖非還端添加GlcA,PAMN-HPLC確定終點(diǎn)(產(chǎn)率>95%)并使用C18填料純化得三糖;依次重復(fù)上述步驟,得到15種結(jié)構(gòu)確定的不同HS骨架寡糖。ESI-MS及1H NMR驗(yàn)證了所得HS寡糖的結(jié)構(gòu)。
4.N-硫酸化的HS寡糖的化學(xué)酶法合成與結(jié)構(gòu)表征
以含三氟乙?;?TFA)的HS三糖骨架為起始原料,用LiOH處理使GlcNTFA脫去TFA形成葡萄糖胺(GlcNH2),然后以PAPS為硫酸
8、基供體,在N-硫酸基轉(zhuǎn)移酶(NST)催化下對(duì)寡糖進(jìn)行N-硫酸化(NS)修飾。以PAMN-HPLC確定終點(diǎn)(產(chǎn)率>95%)并使用強(qiáng)陰離子交換層析純化,得到N-硫酸化的HS三糖(NS-3mer)。HPLC分析顯示產(chǎn)物純度大于99%,ESI-MS及1H NMR驗(yàn)證NS產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。
5.6-O-硫酸化的HS寡糖的酶法合成
以上步NS-3mer為起始原料,以PAPS作為硫酸基供體,在6-O-硫酸基轉(zhuǎn)移酶1和3(6-OST1/3
9、)催化下對(duì)寡糖進(jìn)行6-O-硫酸化(6S)修飾,PAMN-HPLC確定終點(diǎn)(產(chǎn)率>95%)并使用強(qiáng)陰離子交換層析純化得到6-O-硫酸化的三糖(NS6S-3mer)。HPLC分析顯示產(chǎn)物純度大于99%,ESI-MS及1H NMR驗(yàn)證了6S產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。
類似地,以含TFA基團(tuán)的HS骨架五糖、六糖為原料,依次重復(fù)上述NS及6S修飾過程,得到了NS修飾和NS6S修飾的HS五糖及六糖,HPLC鑒定純度均大于95%,ESI-MS及1H NM
10、R驗(yàn)證了產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。
6.HS骨架寡糖的HPLC-CAD/MS分析方法的建立
針對(duì)HS寡糖在分離與鑒定中存在的困難,在HPLC-CAD體系下,分析不同色譜條件下HS骨架寡糖(二糖~八糖)在多孔石墨碳(PGC)色譜柱上的保留行為,首次以等度洗脫實(shí)現(xiàn)了七種寡糖的同時(shí)基線分離,最佳色譜條件為:流動(dòng)相為乙腈/水/甲醇/三氟乙酸(48/48/4/0.2,v/v),流速為0.4ml/min,溫度25℃。將建立的分離方法直接移植到
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