水稻黃單胞桿菌的分子標記致病相關因子的鑒定.pdf

1、水稻白葉枯病和水稻細菌性條斑?。ê喎Q水稻條斑病）是水稻上最重要的兩個細菌性病害，在我國乃至東南亞的某些地區(qū)甚至成為主要病害，危害巨大。其病原菌分別是Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)和X.oryzae pv.oryzicola(Xoc)，同屬于稻黃單胞桿菌，具有非常近的親緣關系，在形態(tài)特征以及生理生化性質(zhì)上十分相似。在病害防治中如初始菌量的調(diào)查、病菌數(shù)量的統(tǒng)計以及日常的種子檢驗檢疫中經(jīng)常造成困難，因此需要

2、方便、快捷及準確的鑒定方法。
　　本研究利用生物信息學技術構建了比較基因組學算法，并且基于現(xiàn)有的全基因組序列對Xoo和Xoc進行分析，獲得了一系列的用于區(qū)分水稻白葉枯病菌與條斑病菌病菌的電子分子標記917對，對其中三種類型的多態(tài)性標記(Xoo特異性、Xoc特異性、Xoo和Xoc共顯性等)隨機選取了130對在40個已得到鑒定的菌株中進行了實驗分析，分別獲得30對Xoo特異性的分子標記，24對Xoc特異性分子標記，14對Xoo和Xoc

3、共顯性的分子標記。這些特異性分子標記可直接應用于檢驗檢疫工作，并可發(fā)展多標記協(xié)同檢測方法，提高了檢測準確性。
　　同時，本研究對水稻條斑病菌中特異的Ⅲ型分泌效應蛋白AvrRxo1進行了研究，開發(fā)出相關特異的分子標記。AvrRxo1是一類non-TAL類效應因子，其生物學功能未知。本研究利用煙草瞬時表達體系發(fā)現(xiàn)，表達AvrRxo1對非寄主煙草細胞具有毒性功能，同時來源于不同Xoc菌株的avrRxo1等位基因的毒性功能存在差異。通過分

4、析五個菌株來源的AvrRxo1的氨基酸序列并結合定點突變驗證，明確了AvrRxo1蛋白的第344位絲氨酸對其毒性功能具有重要作用。進一步對AvrRxo1蛋白分別從氨基端和羧基端進行截短實驗以及預測的關鍵功能結構域位點進行突變實驗，明確了AvrRxo1蛋白羧基端的完整性對其毒性功能的發(fā)揮是必需的。
　　此外，前期研究暗示水稻白葉枯病菌可能代謝產(chǎn)生IAA并將其作為侵染水稻的致病因子。本研究利用同源重組的方法在PXO99A中獲得了四個預

5、測與IAA合成相關基因的突變菌株:P△pxo_04004、P△pxo_04823、P△pxo_00867和P△pxo_03584。利用高效液相色譜儀對野生型菌株PXO99A及其四個突變菌株的代謝產(chǎn)物進行了檢測分析。結果顯示，PXO99A可以代謝生成IAA，產(chǎn)量約為2.6μg/ml，而其突變體代謝IAA產(chǎn)量顯著降低，證明了水稻黃單胞菌中存在多種IAA合成途徑。與預期相反，致病力檢測發(fā)現(xiàn)4個突變菌株相比于野生型PXO99A致病力顯著提高。對

6、突變菌株的生理生化進行檢測，發(fā)現(xiàn)四個突變菌株的重要的致病因子之一胞外多糖(EPS)的產(chǎn)量得到提高。雙向電泳技術的初步分析也顯示了突變菌株在分泌蛋白分泌量和種類上與野生型相比也存在差異，有望揭示IAA負調(diào)控黃單胞桿菌致病因子合成的機制。
　　綜上所述，本研究開發(fā)了大量鑒別Xoo和Xoc的PCR標記，并對其中一個分子標記的靶標基因avrRxo1的致病性功能進行了分析。同時鑒定了Xoo中存在IAA的合成途徑，并證明其參與負調(diào)控黃單胞桿菌