Cuevaenes的生物合成研究與結(jié)構(gòu)改造及ansatrienins后修飾研究.pdf

1、Cuevaenes是一類(lèi)以獨(dú)特的3-羥基苯甲酸(3-hydroxybenzoic acid，3-HBA)為起始單元，由Ⅰ型聚酮合酶(Polyketide Synthase，PKS)合成的線性多烯化合物，具有良好的抗菌和抗腫瘤活性。前期，本實(shí)驗(yàn)室從Streptomyces sp.LZ35中分離獲得了一系列cuevaene類(lèi)化合物，并通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)定位了其生物合成基因簇，明確了分支酸水解酶Cuv10負(fù)責(zé)起始單元合成，但是其聚酮后修飾過(guò)程尚未

2、解析。為此，本論文對(duì)cuevaenes生物合成基因簇中5個(gè)可能參與其后修飾的基因展開(kāi)了研究。通過(guò)對(duì)這5個(gè)基因的敲除和回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)cuv9、cuv18和cuv19為cuevaenes合成的必需基因，而cuv21和cuv23基因的敲除不影響cuevaenes的合成。其中Cuv18與安莎合成途徑中的保守的羥基化酶高度相似，推測(cè)其可能在聚酮鏈延伸過(guò)程中對(duì)3-HBA進(jìn)行羥基化修飾。因此，我們嘗試在體外將Cuv18與ACP形式的底物反應(yīng)，但未

3、能獲得預(yù)期產(chǎn)物。此外，為了進(jìn)一步闡明Cuv10獨(dú)特的催化機(jī)理，我們開(kāi)展了Cuv10的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，通過(guò)點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)推測(cè)了可能的催化活性位點(diǎn)，遺憾的是最終未能獲得Cuv10的高分辨衍射結(jié)果。同時(shí)，鑒于cuevaenes與安莎霉素的合成起始單元(3-氨基5-羥基苯甲酸，AHBA)結(jié)構(gòu)及其加載結(jié)構(gòu)域相似，我們開(kāi)展了cuevaenes的結(jié)構(gòu)改造，通過(guò)將其起始單元加載結(jié)構(gòu)域替換為格爾德霉素的相應(yīng)序列，發(fā)現(xiàn)了一系列可能以AHBA為起始單元的cuev

4、aenes類(lèi)似物，仍有待目標(biāo)產(chǎn)物分離及結(jié)構(gòu)鑒定。
　　安莎三烯(ansatrienins)是以AHBA為起始單元由Ⅰ型聚酮合酶合成的安莎霉素類(lèi)化合物，具有抗真菌和抗腫瘤活性。前期，本實(shí)驗(yàn)室從Streptomy ces sp.XZQH13的LAL調(diào)控基因組成型表達(dá)突變株中分離獲得了安莎三烯類(lèi)化合物，并開(kāi)展了部分O-(N-環(huán)己甲酰)-D-丙氨?；鶄?cè)鏈加載機(jī)制研究。本論文進(jìn)一步通過(guò)PKS基因的敲除、astC和astF1基因的回補(bǔ)、Ast

5、C的點(diǎn)突變闡明了安莎三烯的丙氨?；瘷C(jī)制。另一方面，我們開(kāi)展了起始單元AHBA羥基對(duì)位的羥基化研究，發(fā)現(xiàn)cuv18同源基因astF2基因的敲除終止了安莎三烯的產(chǎn)生，積累了中間產(chǎn)物trienomycin A和trienomycin G，提示AstF2負(fù)責(zé)AHBA羥基對(duì)位的羥基化修飾;遺憾的是，盡管進(jìn)行了多方面的嘗試，AstF2的體外功能研究未能取得成功。
　　綜上所述，本論文發(fā)現(xiàn)了多個(gè)可能參與cuevaenes后修飾反應(yīng)的必需基因，并