冷凍致亞致死金黃色葡萄球菌修復(fù)啟動過程中的生理變化及差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析.pdf

1、本試驗(yàn)以冷凍致亞致死損傷金黃色葡萄球菌ATCC6538為研究對象，探究了不同時間下細(xì)胞的修復(fù)情況、超微結(jié)構(gòu)變化以及其他生理指標(biāo)變化規(guī)律，并通過高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）技術(shù)比較分析了亞致死細(xì)胞修復(fù)啟動過程中的差異蛋白質(zhì)組表達(dá)譜，本試驗(yàn)研究結(jié)果為進(jìn)一步研究冷凍致亞致死金黃色葡萄球菌損傷修復(fù)分子機(jī)制提供一定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　通過對冷凍致亞致死損傷金黃色葡萄球菌在不同修復(fù)時間亞致死損傷細(xì)胞數(shù)目的測定，在-18℃

2、貯藏90d后，99％以上的細(xì)胞為亞致死損傷細(xì)胞。在37℃條件下修復(fù)2 h后，活細(xì)胞數(shù)目趨于穩(wěn)定，99%以上冷凍致亞致死損傷的金黃色葡萄球菌在3 h后完成修復(fù)；利用透射電子顯微鏡觀察修復(fù)啟動過程中超微結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)修復(fù)過程中冷凍致亞致死損傷的金黃色葡萄球菌細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)變化比較明顯，細(xì)胞表面從光滑透明變得致密結(jié)實(shí)；通過紫外分光光度法測定細(xì)胞外泄漏物含量、細(xì)胞活性氧（ROS）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，發(fā)現(xiàn)在修復(fù)前期細(xì)胞內(nèi)核酸和蛋白

3、質(zhì)的泄露量較大，而隨著修復(fù)時間的增加，細(xì)胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)的泄漏速度明顯變慢，而細(xì)胞中的ROS含量降低和SOD活性減弱，冷凍致亞致死損傷的金黃色葡萄球菌修復(fù)過程中，可能是通過細(xì)胞膜完整性的修復(fù)，細(xì)胞恢復(fù)對高鹽脅迫的抵抗能力；通過基因調(diào)控降低細(xì)胞內(nèi)ROS的含量，降低活性氧(O2(-))對細(xì)胞的毒害作用；同時通過產(chǎn)能代謝相關(guān)基因的調(diào)控為細(xì)胞提供修復(fù)所需要的能量，最終冷凍致亞致死損傷的細(xì)胞得到修復(fù)。
　　采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HP

4、LC-MS）技術(shù)比較分析了亞致死細(xì)胞修復(fù)啟動過程中的差異蛋白質(zhì)組表達(dá)譜，并在Uniprot數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索比對，分析鑒定出了118個差異表達(dá)顯著蛋白，其中表達(dá)上調(diào)45個，下調(diào)73個。差異蛋白的Gene Ontology（GO）分析結(jié)果表明，冷凍亞致死金黃色葡萄球菌修復(fù)啟動與細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性蛋白(GntP、AtpC、ModA、MtlF、FabD)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白（NusB、FapR、GreA、RsbV）、氧化還原活性蛋白MtlD、細(xì)胞壁合成相

5、關(guān)蛋白Drp35、核糖體功能相關(guān)蛋白RbfA等有關(guān)。
　　綜上所述，冷凍貯藏過程中，金黃色葡萄球菌細(xì)胞在亞致死損傷狀態(tài)下，細(xì)胞膜、細(xì)胞壁都有一定程度的損傷，表現(xiàn)為對高NaCl濃度的滲透調(diào)節(jié)能力受損。在冷凍致亞致死損傷的金黃色葡萄球菌修復(fù)過程中，通過對相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控，細(xì)胞膜完整性得以修復(fù)，細(xì)胞恢復(fù)對高鹽脅迫的抵抗能力；降低細(xì)胞內(nèi)ROS的含量以及活性氧(O2(-))對細(xì)胞的毒害作用；同時通過產(chǎn)能代謝相關(guān)基因的調(diào)控為細(xì)胞提供修復(fù)所需