不同阻斷方式對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的影響及塞來(lái)昔布保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝臟缺血再灌注損傷(Hepaticischemiareperfusioninjury，I/R)是指肝臟組織缺血一段時(shí)間后恢復(fù)血液灌注，不但不能使其原有功能和結(jié)構(gòu)得以恢復(fù)，反而更為加重其功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷的現(xiàn)象。肝臟缺血再灌注損傷在肝臟外科疾病中是最為常見(jiàn)的一種病理過(guò)程，常見(jiàn)于肝臟移植、肝臟腫瘤切除術(shù)、肝外傷及失血性休克等，可引起嚴(yán)重的肝臟及其他器官功能的衰竭，也是手術(shù)失敗和導(dǎo)致患者死亡的重要原因之一。因此探討肝臟缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展

2、過(guò)程及對(duì)其產(chǎn)生保護(hù)作用的相關(guān)因素及分子機(jī)理，揭示其發(fā)生發(fā)展及保護(hù)作用的精確分子機(jī)制、尋找能夠預(yù)防和治療肝臟缺血再灌注損傷的新型藥物，對(duì)進(jìn)一步提高我國(guó)肝臟疾病的治療水平具有重要意義。
　　 手術(shù)治療是目前治療原發(fā)性和繼發(fā)性肝腫瘤的最佳手段，由于肝臟復(fù)雜的血管分布和豐富的血流供應(yīng)，使得肝臟手術(shù)中極難控制出血。越來(lái)越多臨床實(shí)踐證實(shí)，術(shù)中大量輸血可能導(dǎo)致術(shù)后病死率、并發(fā)癥發(fā)生率增高及肝癌患者長(zhǎng)期生存率降低。所以，術(shù)中阻斷肝臟供血對(duì)于減少

3、術(shù)中出血有著很重要的作用。目前術(shù)中阻斷入肝血流的方法最常用的是肝蒂阻斷法(Pringle法)，可有效的控制術(shù)中發(fā)生的出血，但同時(shí)肝組織缺血再灌注損傷的發(fā)生率較高，甚至導(dǎo)致術(shù)后肝功能衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥。如何根據(jù)病情合理的選擇肝血供的阻斷方式對(duì)于患者術(shù)后肝功能恢復(fù)有著很重要的影響。因此，選擇性入肝血流阻斷，包括半肝阻斷、區(qū)域阻斷以及單純門(mén)靜脈阻斷等方法不僅有效減少術(shù)中出血，而且非常有助于術(shù)后肝功能的恢復(fù)。
　　 環(huán)氧化酶(Cycloo

4、xygenase，COX)是催化花生四烯酸(arachidonicacid，AA)合成前列腺素(Prostaglandin，PG)和血栓素(Thromboxane，TX)的關(guān)鍵限速酶。COX通常以兩種亞型存在于組織中。COX-1為結(jié)構(gòu)型，存在于大多數(shù)組織中，催化生成維持正常生理功能所需要的前列腺素;COX-2為誘導(dǎo)型，在正常情況下大多數(shù)的組織中表達(dá)極低，但是在炎癥、腫瘤、缺血再灌注等過(guò)程中表達(dá)明顯增加。有研究表明，COX-2參與了缺血后

5、腦損傷的發(fā)生、發(fā)展，并與腦缺血的預(yù)后關(guān)系密切。
　　 塞來(lái)昔布(Celecoxib)是一種選擇性的COX-2抑制劑，化學(xué)名為4-[5-（甲苯基）-3-（三氟甲基）-1-H-吡唑-1-基]苯磺酰胺，它能抑制COX-2的高表達(dá)，從而抑制花生四烯酸的代謝產(chǎn)物PGI2與TXA2的比例(TXA2/PGI2)水平失衡，減輕炎癥反應(yīng)，改善微循環(huán)，減輕組織損傷和細(xì)胞水腫，從而減少肝臟I/R的程度。臨床上主要用于骨關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療，在

6、腦缺血再灌注的研究表明其可能通過(guò)降低腦組織中TXA2/PGI2的比值，減輕炎癥反應(yīng)，改善微循環(huán)，減輕腦損傷和腦水腫，且可減少氧自由基的產(chǎn)生，提高SOD活性從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。目前關(guān)于COX-2對(duì)缺血再灌注的直接作用研究主要還是集中在COX-2對(duì)腦缺血再灌注損傷等領(lǐng)域，而關(guān)于COX-2對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的研究還比較少，許多問(wèn)題還未得到徹底闡明。本實(shí)驗(yàn)在建立的大鼠肝臟的缺血再灌注模型中加用不同劑量塞來(lái)昔布來(lái)抑制COX-2的活性，通過(guò)測(cè)定各

7、組大鼠缺血灌注后肝臟中COX-2、p-Stat3（pTry705）等的表達(dá)水平，進(jìn)一步探討塞來(lái)昔布在肝臟缺血再灌注損傷中的作用及其詳細(xì)機(jī)制。
　　 目的:1.觀察不同阻斷方式對(duì)肝臟I/R的影響。2.觀察塞來(lái)昔布對(duì)大鼠肝臟I/R的影響及作用機(jī)制。
　　 方法:1.選用健康雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為2組(n=30)，分別為:單純門(mén)靜脈阻斷組（A組）:充分暴露肝門(mén)部，仔細(xì)分離左、中肝的肝蒂，小心剝離其表面的Glisson鞘和

8、膽管，分離門(mén)靜脈與肝動(dòng)脈，用無(wú)損傷動(dòng)脈夾夾閉左、中門(mén)靜脈分支，同時(shí)保留左、中肝動(dòng)脈及右肝血供。肝蒂阻斷組（B組）:充分暴露肝門(mén)部，分離肝左、中葉的門(mén)靜脈、肝動(dòng)脈及膽管，用無(wú)損傷動(dòng)脈夾夾閉整個(gè)左、中肝肝蒂。兩組均夾閉60min，恢復(fù)血流后于1、3、6、12、24h取血液標(biāo)本檢測(cè)ALT、AST的濃度;取肝臟組織標(biāo)本檢測(cè)MDA、MPO的濃度。2.選用健康雄性SD大鼠30只，隨機(jī)分為5組(n=6)，分別為:Ⅰ組（對(duì)照組）:開(kāi)腹阻斷門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈

9、后給予生理鹽水灌胃;Ⅱ組（假手術(shù)組）:開(kāi)腹未阻斷門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈，關(guān)腹;Ⅲ組（低劑量塞來(lái)昔布組）:開(kāi)腹阻斷門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈后給予塞來(lái)昔布10mg/kg灌胃;Ⅳ組（中劑量塞來(lái)昔布組）:開(kāi)腹阻斷門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈后給予塞來(lái)昔布20mg/kg灌胃;Ⅴ組（高劑量塞來(lái)昔布組）:開(kāi)腹阻斷門(mén)靜脈和肝動(dòng)脈后給予塞來(lái)昔布40mg/kg灌胃。各組均夾閉肝蒂30min后開(kāi)放6小時(shí)，取血液標(biāo)本檢測(cè)ALT、AST的濃度，以確定肝臟缺血再灌注后損傷高峰時(shí)相和塞來(lái)昔布的保護(hù)

10、作用;取肝臟組織標(biāo)本檢測(cè)MDA、MPO的濃度;通過(guò)HE染色方法觀察肝臟損傷的情況;Westernblot方法檢測(cè)COX-2、STAT3及p-Stat3(pTry705)在肝臟組織中的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:1.通過(guò)監(jiān)測(cè)大鼠體內(nèi)ALT、AST、MDA及MPO的濃度，我們發(fā)現(xiàn)，與肝蒂阻斷組比較，單純門(mén)靜脈阻斷組血液內(nèi)ALT和AST的濃度均明顯下降（P＜0.05），同時(shí)，單純門(mén)靜脈阻斷組血液內(nèi)MDA和MPO的濃度均明顯低于肝蒂阻斷組（

11、P＜0.05）。2.通過(guò)監(jiān)測(cè)大鼠體內(nèi)ALT、AST、MDA及MPO的濃度，我們發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，對(duì)照組血液內(nèi)ALT和AST的濃度均明顯升高(P＜0.05)，與對(duì)照組比較，不同濃度的塞來(lái)昔布組的ALT和AST的濃度均有所下降，其中以中劑量塞來(lái)昔布組最為明顯（P＜0.05）;同時(shí)，與假手術(shù)組比較，對(duì)照組血液內(nèi)MDA和MPO的濃度均明顯升高(P＜0.05)，與對(duì)照組比較，不同濃度的塞來(lái)昔布組的MDA和MPO的濃度均有所下降（P＜0.05）

12、，其中以中劑量塞來(lái)昔布組最為明顯，提示再灌注后6小時(shí)肝臟損傷明顯，而塞來(lái)昔布可逆轉(zhuǎn)肝臟的缺血再灌注損傷。HE染色發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組僅見(jiàn)少量細(xì)胞水腫，肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常;而對(duì)照組肝血竇充血、擴(kuò)張明顯，肝臟細(xì)胞水腫明顯，細(xì)胞核深染，可見(jiàn)少量片狀壞死;塞來(lái)昔布處理組見(jiàn)部分肝細(xì)胞水腫，核深染，可見(jiàn)點(diǎn)狀細(xì)胞壞死，匯管區(qū)輕度擴(kuò)張，偶有少量充血，其中，中劑量組肝臟細(xì)胞損傷程度較低。Westernblot法檢測(cè)COX-2、STAT3及p-Stat3（pTry

13、705）的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，對(duì)照組COX-2及p-Stat3(pTry705)的表達(dá)水平均明顯升高(P＜0.05)，與對(duì)照組比較，不同濃度的塞來(lái)昔布組COX-2及p-Stat3（pTry705）的表達(dá)水平均下降，其中以中劑量塞來(lái)昔布組最為明顯(P＜0.05);STAT3在各實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)水平并無(wú)明顯變化，提示塞來(lái)昔布對(duì)大鼠肝臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用與COX-2及p-Stat3相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 1.

14、區(qū)域阻斷血供切肝術(shù)是一種安全的手術(shù)方式，可以有效的減少患者術(shù)中肝臟的損傷以及利于術(shù)后肝功能的恢復(fù)。
　　 2.單純門(mén)靜脈阻斷的大鼠肝臟缺血再灌注損傷比肝蒂阻斷的大鼠較輕，其機(jī)理可能與再灌注后脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)有關(guān)。
　　 3.塞來(lái)昔布可降低ALT、AST及MDA、MPO的表達(dá)水平從而對(duì)肝臟缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用，并且以中等劑量(20mg/kg)效果較好。
　　 4.塞來(lái)昔布對(duì)肝臟缺血再灌注損傷的保