劍麻皂苷元生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)方法的研究.pdf

1、天然皂苷元具有豐富的多元化藥理特性，如抗炎、抗菌、鎮(zhèn)痛、止血、抗衰老和降血糖等多種功效，同時(shí)作為一種重要的藥物中間體被廣泛應(yīng)用于制造腎上腺皮質(zhì)激素、性激素以及蛋白同化激素等三大類200多種藥物。傳統(tǒng)的酸堿化工分離提取技術(shù)已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足當(dāng)前工業(yè)化生產(chǎn)皂苷元的需求，同時(shí)廢酸廢堿的排放造成環(huán)境污染;另外，劍麻抽絲時(shí)僅僅利用了劍麻葉片的5％，其余95％成分沒有被利用。為此，我們提出了生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)劍麻皂苷元的方法。
　　本文在劍麻總皂苷的

2、分離提取和劍麻皂苷元的純化上分別采用大孔樹脂法和硅膠柱層析法;在線檢測上分別建立了流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法檢測劍麻總皂苷和皂苷元;在末端檢測上建立了反向高效液相/蒸發(fā)光散射檢測器色譜法檢測劍麻皂苷元;在產(chǎn)劍麻皂苷元菌株的生物轉(zhuǎn)化上，對篩選到的菌株ZG-21進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方面的鑒定，并對其直接發(fā)酵產(chǎn)劍麻皂苷元的條件及在發(fā)酵過程中各種微量金屬離子的濃度進(jìn)行了優(yōu)化;在轉(zhuǎn)化劍麻皂苷元的菌株ZG-21的酶學(xué)特性上，對粗提取的降解酶與劍麻總皂苷

3、的酶促反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。為實(shí)現(xiàn)劍麻皂苷元的清潔生產(chǎn)工藝提供了理論基礎(chǔ)。
　　本文的主要研究結(jié)果如下:
　　1、在劍麻總皂苷的分離提取方面，本文分別考察了D-101、D-101C、DA201-H、LX-22、LX-68M、LXA-8和LX-762等7種大孔樹脂的靜態(tài)吸附與解吸劍麻總皂苷的性能，其中D-101C為最優(yōu)，吸附率和解吸率分別為75.1％和84.8％;另外，70％的乙醇是解吸該樹脂并提取總皂苷的最佳濃度。
　　

4、2、在劍麻皂苷元的純化方面，本文選擇硅膠作為固定相，氯仿∶甲醇∶水=80∶20∶5(V/V/V)三元體系作為流動(dòng)相，流速1mL/min，定時(shí)2 min收集一次，經(jīng)洗脫曲線分析得到21-25管為劍麻皂苷元的純化樣品，由反向高效液相/蒸發(fā)光散射檢測器色譜法的色譜圖進(jìn)一步證實(shí)，該方法分離純化劍麻皂苷元可獲得95％以上的相對標(biāo)準(zhǔn)品。
　　3、在末端檢測方法方面，本文建立了反向高效液相/蒸發(fā)光散射檢測器色譜法檢測劍麻皂苷元，獲得該方法的標(biāo)準(zhǔn)

5、曲線方程為y=6688.8x-77788，R2=0.9996，在50-2000μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，最低檢出限可以達(dá)到5μg/mL。
　　4、在線檢測方法方面，本文選用靈敏度較高的魯米諾-鐵氰化鉀化學(xué)發(fā)光體系，通過對檢測試劑濃度條件的優(yōu)化，分別建立了流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法檢測劍麻總皂苷和皂苷元的方法。
　　(1)當(dāng)魯米諾濃度4.0×10-5mol/L，鐵氰化鉀濃度3.0×10-5mol/L，配制魯米諾的氫氧化鈉溶液

6、濃度為0.1mol/L時(shí)，為檢測劍麻皂苷最優(yōu)條件，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1576.7x+20093，R2=0.9973，其中x以mg/mL計(jì)，濃度在0.1-5.0mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。
　　(2)當(dāng)用0.1mol/L氫氧化鈉溶液配制魯米諾濃度1.0×10-5mol/L，鐵氰化鉀濃度1.6×10-5mol/L，且皂苷元溶解在無水乙醇中時(shí)為檢測劍麻皂苷元的最優(yōu)條件，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=721.41x+25.242，R2=0.9

7、996其中x以mg/mL計(jì)，濃度在0.1-1.0mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。
　　5、在轉(zhuǎn)化劍麻皂苷元菌株的篩選方面，本文從采集自具有喀斯特地貌的桂林冠巖周邊384份土壤樣品中，通過初篩獲得22株可在劍麻總皂苷為碳源的培養(yǎng)基上生長的菌株，其中包括17株桿菌和5株球菌。再通過復(fù)篩獲得降解率相對較高的4株桿菌ZG-04、ZG-14、ZG-19、ZG-21和球菌中降解率相對較高的ZG-15，對5個(gè)菌株發(fā)酵后的產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)僅

8、有ZG-21轉(zhuǎn)化劍麻皂苷元的得率比較高。
　　6、在轉(zhuǎn)化劍麻皂苷元菌株ZG-21的發(fā)酵方面，通過對發(fā)酵條件（溫度、時(shí)間和pH值）單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化，得到最優(yōu)發(fā)酵工藝為:溫度32℃，時(shí)間5d，pH值為6;微量金屬離子濃度干擾發(fā)酵效果實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一定濃度的Na+、K+和Cu2+對發(fā)酵有促進(jìn)作用，Mg2+、Al3+和NH4Cl對發(fā)酵有抑制作用，而Fe3+對發(fā)酵影響不大。
　　7、在轉(zhuǎn)化劍麻皂苷元菌株ZG-21的酶學(xué)特性方面，對ZG

9、-21菌株的發(fā)酵液進(jìn)行皂苷降解酶的提取，并研究了溫度、時(shí)間和pH對酶促反應(yīng)的影響，得到最優(yōu)酶促反應(yīng)條件:溫度33℃，時(shí)間為12h，底物pH值為6;金屬離子干擾酶促反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Cu2+、Zn2+和Ca2+對酶促反應(yīng)有促進(jìn)作用，Al3+和Ag+則對酶促反應(yīng)產(chǎn)生了抑制作用，而其他的Na+、K+、Mg2+、Fe3+、Co2+對酶促反應(yīng)影響不大;利用葡聚糖凝膠柱層析法對粗制ZG-21菌株皂苷降解酶進(jìn)行了進(jìn)一步純化，經(jīng)過純化后的皂苷降解酶發(fā)