離子液體雙水相萃取分離生物活性物質(zhì)及其機(jī)理的研究.pdf

1、雙水相萃取技術(shù)是提取和純化生物活性物質(zhì)的一種新型分離方法，其操作條件溫和、易于放大、且可連續(xù)操作。離子液體雙水相是基于高聚物雙水相發(fā)展而來的一種高效溫和萃取分離體系。與傳統(tǒng)的雙水相萃取技術(shù)不同，離子液體雙水相技術(shù)采用親水性的離子液體(ILs)與無機(jī)鹽的水溶液進(jìn)行混合，在水中以較高的濃度溶解后形成互不相溶的兩相。它有效地將離子液體與雙水相萃取技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)相結(jié)合，不僅具有無毒、安全、簡便、快速的特點(diǎn)，而且溶液酸度和溶解度可調(diào)、不易乳化、界面更

2、為清晰等。此外，該技術(shù)還具有在萃取過程中保持生物物質(zhì)的活性和構(gòu)象的優(yōu)勢。幾年來，離子液體雙水相越來越受到人們的關(guān)注。
　　 本研究分別以小分子物質(zhì)中藥羅布麻中的金絲桃苷和異槲皮苷和大分子物質(zhì)蛋白質(zhì)為研究對象，將離子液體雙水相技術(shù)應(yīng)用于生物活性物質(zhì)的萃取分離并對其萃取機(jī)理展開了研究，以期為生物活性物質(zhì)的預(yù)處理工作提供理論依據(jù)。具體內(nèi)容如下:
　　 1、離子液體微波輔助萃取結(jié)合雙水相提取中藥中的金絲桃苷和異槲皮苷
　　

3、 將離子液體微波輔助萃取與雙水相技術(shù)相結(jié)合萃取富集中藥羅布麻中的金絲桃苷和異槲皮苷，并對其機(jī)理進(jìn)行了研究。通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對金絲桃苷和異槲皮苷提取富集工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到最佳萃取富集條件為:0.2 g/mL的[bmim][BF4]溶液作為萃取溶液，在固液比0.02 g/mL，萃取溫度60℃條件下，對中藥羅布麻萃取10 min。提取液加入鹽NaH2PO4后中藥羅布麻的提取液將被富集到上相中。使用反相高效液相色譜法檢測金絲桃苷和異

4、槲皮苷的含量。使用這種方法萃取富集中藥羅布麻的提取液，金絲桃苷和異槲皮苷具有更高的檢測限，分別為3.82μg/L和3.00μg/L，以及較高的提取效率，分別為64％和62％。方法學(xué)考察的結(jié)果表明:儀器精密度良好，RSD分別為0.75％和0.59％;方法重現(xiàn)性良好，RSD分別為3.2％和2.9％;穩(wěn)定性很高，RSD分別為0.49％和0.96％。萃取機(jī)理研究結(jié)果表明:ILs-MAE的提取率主要取決于微波過程中對樣品微結(jié)構(gòu)的破壞，過長的萃取時(shí)

5、間并不利于金絲桃苷和異槲皮苷萃取率的提高。
　　 2、離子液體雙水相萃取分離蛋白質(zhì)
　　 建立了一種離子液體雙水相萃取-紫外光譜分析并定量檢測蛋白質(zhì)的方法。本研究分別在277 nm、404 nm和280 nm的檢測波長對牛血清白蛋白、牛血紅蛋白和溶菌酶進(jìn)行紫外檢測。咪唑類離子液體的萃取效果優(yōu)于胍類和嗎啉類離子液體，并且咪唑類離子液體的烷基鏈越長越有利于蛋白質(zhì)的萃取。選用3.0mmol[omim][Br]，55％ K2HP

6、O4鹽溶液，10 mg/mL的樣品加入量，在最佳pH值處升溫至45℃，提取10 min可得到最佳的萃取效率。雙水相提取后牛血清白蛋白、牛血紅蛋白和溶菌酶的回收率分別為96.90％(RSD=2.8％)、97.83％(RSD=2.9％)和97.14％(RSD=2.4％)。所擬方法回收率、重現(xiàn)性均較好，且適用于牛血清白蛋白和牛血紅蛋白混合樣品的檢測，為蛋白質(zhì)分離提取提供了一種新思路。
　　 3、離子液體雙水相萃取分離蛋白質(zhì)的機(jī)理研究<

7、br>　　 為了進(jìn)一步對提取蛋白質(zhì)的機(jī)理進(jìn)行研究，首先使用了紫外光譜分析牛血清白蛋白、牛血紅蛋白、溶菌酶和胰蛋白酶萃取前后的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)雙水相的萃取后蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)并未發(fā)生顯著變化。使用胰蛋白酶考察萃取溫度和保存溫度對活性的影響。離子液體雙水相在大于45℃的條件下保存2h，溫度越高，雙水相體系上相萃取液顏色越深，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)將發(fā)生變化。離子液體雙水相體系[omim][Br]/K2HPO4采用常溫萃取后保存的方法更利于胰蛋白酶發(fā)揮作用。之后