雙水相萃取資料

1、雙水相萃取技術(shù) ( aqueous two-phase extraction ),主要內(nèi)容：一、雙水相萃取的基本理論二、雙水相萃取工藝流程操作三、影響雙水相的因素四、雙水相萃取的應(yīng)用五、雙水相萃取技術(shù)的發(fā)展,,雙水相萃取現(xiàn)象最早是1896年由Bei jerinck在瓊脂與可溶性淀粉或明膠混合時發(fā)現(xiàn)的，這種現(xiàn)象被稱為聚合物的“不相溶性” (incompatibility)。20世紀60年代瑞典Lund大學(xué)的Albertsso

2、n P A及其同事們最先提出雙水相萃取技術(shù)并做了大量的工作。70年代中期西德的Kula M R和Kroner K H等人首先將雙水相系統(tǒng)應(yīng)用于從細胞勻漿液中提取酶和蛋白質(zhì)，大大改善了胞內(nèi)酶的提取效果。,前 言,一、雙水相萃取的基本理論,1、雙水相體系的組成2、雙水相萃取的特點3、雙水相萃取原理,1、雙水相體系的組成,雙水相體系的主要成因——聚合物的不相溶性,雙水相現(xiàn)象是當兩種聚合物或一種聚合物與一種鹽溶于同一溶劑時，由于聚合物

3、之間或聚合物與鹽之間的分子空間阻礙作用，無法相互滲透，當聚合物或無機鹽濃度達到一定值時，就會分成不互溶的兩相，因為使用的溶劑是水，所以稱為雙水相。,① 聚合物∕聚合物雙水相,當2種聚合物混合時，由于2種聚合物間存在較強的斥力或空間阻礙，使2者無法相互滲透，不能形成均一相，故達到平衡后形成兩相，這2種聚合物分別位于互不相溶的兩相中，即形成聚合物/聚合物雙水相體系。,聚合物雙水相形成機理,兩種聚合物,,相互混合,,,混合,體系熵的增加,兩個

4、因素,分子間作用力,分離（聚合物的不相容性）,,分相,,富含不同聚合物的兩相,形成雙水相的雙聚合物體系很多，如聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)/葡聚糖(dextran，Dx)，聚丙二醇(polypropylene glycol) / 聚乙二醇和甲基纖維素(methylcellulose)/葡聚糖等。雙水相萃取中常采用的雙聚合物系統(tǒng)為PEG/Dx，該雙水相的上相富含PEG，下相富含Dx。,②聚合物∕無機鹽雙水相

5、,某些聚合物溶液和一些無機鹽溶液相混時，在一定濃度下，由于鹽析作用，也會形成兩相，即聚合物/ 無機鹽雙水相體系，常用的無機鹽有磷酸鹽和硫酸鹽。除高聚物、無機鹽外，能形成雙水相體系的物質(zhì)還有高分子電解質(zhì)、低分子量化合物。,各種類型的雙水相體系,雙水相的形成,在聚合物∕鹽或聚合物∕聚合物系統(tǒng)混合時，會出現(xiàn)兩個不相混溶的水相,,,PEG = 聚乙二醇(polyethylene glycol),Kpi = 磷酸鉀,DX = 葡聚糖(dextr

6、an),2、雙水相體系的特點,優(yōu)點：,操作條件溫和，在常溫常壓下進行。兩相的界面張力小，一般在10-4N/cm量級，兩相易分散。兩相的相比隨操作條件而變化。,易于連續(xù)操作，處理量大，適合工業(yè)應(yīng)用。兩相的溶劑都是水，上相和下相的含水量高達70%～90%，不存在有機溶劑殘留問題。,缺點：,成相聚合物的成本較高，且高聚物回收困難。水溶性高聚物大多數(shù)粘度較大，不易定量控制。易乳化，相分離時間較長。影響因素復(fù)雜。,3、雙水相萃取原理,

7、(1) 分配系數(shù) 雙水相萃取與一般的水-有機物萃取的原理相似, 都是依據(jù)物質(zhì)在兩相間的選擇性分配。當萃取體系的性質(zhì)不同, 物質(zhì)進入雙水相體系后, 由于分子間的范德華力、疏水作用、分子間的氫鍵、分子與分子之間電荷的作用, 目標物質(zhì)在上、下相中的濃度不同, 從而達到分離的目的。,其分配規(guī)律服從Nernst分配定律，即K=Ct/Cb，其中Ct、Cb分別為上相和下相的濃度，K為分配系數(shù)。各種物質(zhì)的分配系數(shù)K是不一樣的，因而雙水相體系

8、對生物物質(zhì)的分配具有很大的選擇性。 系統(tǒng)固定時,分配系數(shù)K為一常數(shù), 與溶質(zhì)的濃度無關(guān)。當目標物質(zhì)進入雙水相體系后， 在上相和下相間進行選擇性分配，這種分配關(guān)系與常規(guī)的萃取分配關(guān)系相比，表現(xiàn)出更大或更小的分配系數(shù)。,(2) 萃取率 當某一物質(zhì)A的水溶液, 用有機溶劑萃取時, 則萃取率E應(yīng)該等于: 有機相中被萃取物的量 兩相中被萃取物的量,,,×100%,E=,萃取率反應(yīng)了物

9、質(zhì)被萃取的完全程度。 雙水相萃取是一種可以利用較為簡單的設(shè)備，并在溫和條件下進行簡單操作就可獲得較高收率和純度的新型分離技術(shù)。,雙水相體系中相關(guān)的計算公式為：R=Vt／Vb，K=Ct／Cb，G=1/RK，Y=（1+1／RK）-1 ×100％式中：R－相比；Vb－下相體積，mL；Vt－上相體積，mL； K－分配系數(shù)；Cb－下相溶質(zhì)的質(zhì)量濃度，g／mL；Ct －上相溶質(zhì)的質(zhì)量濃度，g／mL；G－上、下相溶質(zhì)的

10、質(zhì)量比；Y－萃取率，％。,(3) 雙水相相圖制作,以PEG4000∕硫酸銨雙水相體系為例,①建立PEG4000的吸光度-質(zhì)量分數(shù)標準曲線,②建立硫酸銨的電導(dǎo)率-質(zhì)量分數(shù)標準曲線,③建立PEG4000∕硫酸銨雙水相相圖,約取5mL20%的PEG4000溶液溶于50mL的離心管里面,用100μL移液器逐滴加入40%的硫酸銨溶液,振蕩混勻直至出現(xiàn)渾濁，將混合液放在離心機上離心5min,溶液分層后分別取其上、下相各1克稀釋100倍,并測其電導(dǎo)

11、率記錄數(shù)據(jù)。再取溶液上下相的溶液各1克溶于100mL容量瓶中，測定其吸光度并記錄數(shù)據(jù)。,接著在混合液中加入一定量的去離子水至渾濁變澄清，再次逐滴加入硫酸銨溶液至出現(xiàn)渾濁且半分鐘內(nèi)渾濁不變化，重復(fù)上述步驟。根據(jù)測量數(shù)據(jù)作出PEG4000∕硫酸銨溶液的雙水相相圖。,圖中的曲線為雙結(jié)線(Binodal)，雙結(jié)線以下的區(qū)域為均相區(qū)，以上的區(qū)域為兩相區(qū)，也稱為工作區(qū)。連接雙結(jié)線上兩點的直線稱為系線(Tie一line，簡稱TL)，表示了雙水相體系達

12、到相平衡時上、下相組成和總組成的關(guān)系。,雙水相體系的雙結(jié)線模型,系線上的各點上下相的組成相同，而體積不同，上下相的體積比近似服從杠桿原理，即： Vt/Vb=Ab/At 其中， Vt/Vb分別為上相和下相體積，Ab/At分別為A點與B點和A點與T點之間的距離。,雙水相體系的雙結(jié)線模型,雙水相體系的雙結(jié)線模型,系線長度通過下式計算：,△代表上下相的濃度差。一般情況下，體系對被分配物質(zhì)的處理能力與系線長度成正比。,雙水相體系的

13、雙結(jié)線模型,系線越長，界面張力就越大，兩相間的性質(zhì)差別就越大，被分配物質(zhì)在相間分配系數(shù)K亦越大;反之就越小。當系線長度趨向于零即接近于臨界點 (criticalpoini，簡稱Cp)時，兩相差別消失，界面張力為零，體系成為均一的一相。,a,雙節(jié)線,系線,b,雙節(jié)線,,均相區(qū),,均相區(qū),兩相區(qū),兩相區(qū),系線,,,臨界點,,,二、雙水相萃取工藝流程操作,工藝流程主要由三部分組成：,目標產(chǎn)物的萃取聚合物（PEG)的循環(huán)無機鹽的循環(huán),雙水相

14、萃取工藝流程圖,,,,上相,,,萃取液,PEG無機鹽,｝,ATPE,相似相溶原理,相體系回收示意圖,PEG的循環(huán) 在大規(guī)模雙水相萃取過程中，成相材料的回收和循環(huán)使用，不僅可以減少廢水處理的費用，還可以節(jié)約化學(xué)試劑，降低成本。PEG回收有2種方法：一種即前面所述的加入鹽使蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入富鹽相來回收PEG，一種是將PEG通過離子交換樹脂，洗脫劑先洗出PEG，再洗出蛋白質(zhì)?，F(xiàn)在常用的方法是將第1步萃取的PEG相或除去部分蛋白質(zhì)的PEG相循

15、環(huán)利用。,無機鹽的循環(huán) 一種方法是將無機鹽相冷卻，如將含磷酸鈉的鹽相冷卻到6℃，使鹽結(jié)晶析出，然后用離心機分離收集；另一種是用電滲析法、膜分離法回收鹽類或除去PEG相的鹽。雙水相萃取所用的設(shè)備一般都是其他兩相體系如水和有機溶劑體系所通用的設(shè)備，有商業(yè)化的混合器和沉淀器系統(tǒng)以及離心分離機已成功應(yīng)用于雙水相萃取。,盡管剛開始應(yīng)用時，大多數(shù)雙水相萃取是間歇式的，但此技術(shù)更適合于錯流萃取的連續(xù)生產(chǎn)，這樣可有效利用空間和時間，尤其是在與其

16、他分離技術(shù)如凝膠過濾、膜分離等相結(jié)合使用時。1988 年，Hustedt 等人證明在工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模上可將雙水相體系用于連續(xù)錯流萃取延胡索酸酶和青霉素配基轉(zhuǎn)移酶。,三、影響雙水相萃取的因素,影響雙水相萃取平衡的主要因素有：組成雙水相體系的高聚物類型、高聚物的平均分子量和分子量分布、高聚物的濃度、成相鹽和非成相鹽的種類、鹽的離子濃度、pH值、溫度等。,1）聚合物的類型,不同聚合物的水相系統(tǒng)顯示出不同的疏水性，聚合物的疏水性按下列次序遞增：葡萄

17、糖硫酸鹽糖＜葡萄糖＜羥丙基葡聚糖＜甲基纖維素＜聚乙二醇＜聚丙三醇，這種疏水性的差異對目的產(chǎn)物的作用是重要的。,2）聚合物及其相對分子質(zhì)量,不同聚合物的水相系統(tǒng)，疏水性不同；同一聚合物，疏水性隨分子量增加而增加，其大小的選擇取決于萃取過程的目的和方法，在PEG/Dex體系中，PEG分子量的減少，會使萃取液在兩相中的分配系數(shù)增大，當PEG的分子量增加時，在質(zhì)量濃度不變的情況下，親水性蛋白質(zhì)不再向富含PEG相中聚集而轉(zhuǎn)向另一相。,在雙水相系統(tǒng)

18、中，界面張力很低并且隨雙曲線長度呈指數(shù)規(guī)律的增大。當系統(tǒng)組成處于臨界點時，系線長度為零，上下相組成相同，萃取液均勻地分配在兩相中，分配系數(shù)K=1。當成相聚合物的總濃度或聚合物/鹽混合物的總濃度增加時，系統(tǒng)遠離臨界點，系線長度增大，兩相性質(zhì)的差別也增大，同時萃取液在兩相中界面張力的差別增大，使其趨于向一側(cè)分配，即K值或增大超過1，或減小低于1。,3）聚合物的濃度,4）溫度的影響,溫度的變化影響相物理性質(zhì)的變化，例如粘度和密度等，從而影響萃

19、取液的分配。但總的來說，溫度對分配系數(shù)的影響是通過對相圖的影響來間接達到的。在臨界點附近，溫度對相圖的影響最顯著，對分配系數(shù)的影響最強。當遠離臨界點時，溫度對相圖的影響較小，分配系數(shù)對溫度的變化也不敏感。這是由于遠離臨界點時，成相聚合物的濃度增大，對萃取液的穩(wěn)定作用增強。,但一般來說，當雙水相系統(tǒng)離雙節(jié)線足夠遠時，溫度的影響很小，1-2度的溫度改變不影響目標產(chǎn)物的萃取分離。 大規(guī)模雙水相萃取操作一般在室溫下進行，不需冷卻。這是基

20、于以下原因： (l)常溫下，溶液的粘度較低，容易分相 (2)成相聚合物PEG對某些具有生物活性溶質(zhì)如蛋白質(zhì)有穩(wěn)定的作用，常溫下蛋白質(zhì)一般不會發(fā)生失活、變性。 (3)常溫操作節(jié)省冷卻費用。,溫度對雙水相系統(tǒng)的影響,體系pH值會影響溶液分子中可離解基團的離解度，從而改變分子表面的電荷數(shù)來影響分配。同時PH值還會影響緩沖離子如HPO42-、PO43-等的分配，以改變相間電位來達到改變分配系數(shù)的目的。另外在研究分配系數(shù)與pH值

21、的關(guān)系時，若加入不同種類的中性鹽，由于電位差的不同，其相應(yīng)關(guān)系也不同。,5）PH值的影響,6）無機鹽的濃度,鹽的正、負離子在兩相間分配系數(shù)不同，兩相間形成電位差，從而影響帶電生物大分子的分配。無機鹽濃度的不同能改變兩相間的電位差。,利用雙水相萃取技術(shù)分離純化時，其選擇雙水相體系的一般原則是:(l)目標產(chǎn)物在兩相中有較大的分配系數(shù)(2)能保持具有生物活性溶質(zhì)的活性(3)體系易于分相，可利用靜止或者離心沉降法進行分相(4)降低操作成

22、本，采用廉價的雙水相體系來萃取分離,綜合利用以上因素，可通過實驗確定最佳雙水相萃取系統(tǒng)。以PEG/硫酸銨雙水相體系萃取一種蛋白質(zhì)為例：（1）固定硫酸銨為某一濃度，用梯度濃度的聚乙二槨與其形成一系列雙水相體系，萃取分離蛋白質(zhì)，分別測量上、下相蛋白質(zhì)的含量，確定PEG的最佳濃度。（2）選?。?）中的最佳PEG濃度，在此濃度下與梯度濃度的硫酸銨形成雙水相體系，進行蛋白質(zhì)的萃取分離，測定上、下相中蛋白質(zhì)的含量，確定出最佳的硫酸銨濃度。,（3

23、）在（1）和（2）的基礎(chǔ)上，選用最佳的PEG濃度和硫酸銨濃度組成雙水相體系，在蛋白質(zhì)穩(wěn)定的PH范圍，用一系列不同PH值的緩沖液調(diào)節(jié)雙水相體系的酸堿環(huán)境，測定上、下相中蛋白質(zhì)的含量，確定出最佳的PH范圍。（4）在最佳PEG濃度、硫酸銨濃度和PH值的基礎(chǔ)上，用相同的方法得到最適宜的溫度。,四、雙水相萃取的應(yīng)用,雙水相萃取自發(fā)現(xiàn)以來，無論在理論上還是實踐上都有很大的發(fā)展，在最近幾年中更為突出，在若干生物工藝過程中得到了應(yīng)用，其中有： 分

24、離和提取各種蛋白質(zhì)（酶） 提取抗生素和分離生物粒子 天然產(chǎn)物的分離提取 基因工程藥物的分離與提取,五、雙水相萃取技術(shù)的發(fā)展方向,新型雙水相體系的開發(fā)——降低分離成本 用變性淀粉取代葡聚糖 用羥基纖維取代聚乙二醇,親和雙水相萃取技術(shù) 親和雙水相萃取技術(shù)是指在成相高聚物上偶聯(lián)親和性配基，以提高溶質(zhì)的分配系數(shù)。 利用金屬離子和蛋白質(zhì)中精氨酸、組氨酸的親和作用,新型功能雙水相體系,高速逆流雙水相色譜,高速