殼聚糖酶解動力學(xué)及其影響因素研究.pdf

1、殼聚糖因其具有良好的性能，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品、造紙、印染和日化等領(lǐng)域，成為21世紀(jì)重點開發(fā)的生物新材料。木瓜蛋白酶能高效降解殼聚糖且便宜，易于工業(yè)化。因此，研究木瓜蛋白酶對殼聚糖的水解特性能夠?qū)γ傅幕瘜W(xué)本質(zhì)、殼聚糖的化學(xué)特性做出深入的了解，有助于探討非專一性酶水解殼聚糖機(jī)理，同時為水溶性低聚糖的工業(yè)生產(chǎn)提供理論指導(dǎo)。
　　用木瓜蛋白酶對水分含量為8.49％，脫乙酰度為91.94%的殼聚糖進(jìn)行水解，探究各因素對水解反應(yīng)影響

2、發(fā)現(xiàn)，酶解解較佳條件是底物濃0.6 mg/mL、酶底物比10.0％、pH4.5、45°C。
　　考慮底物濃度對木瓜蛋白酶解殼聚糖動力學(xué)影響的基礎(chǔ)上，根據(jù)中間產(chǎn)物理論，構(gòu)建了木瓜蛋白酶解殼聚糖的底物抑制動力學(xué)模型。采用非線性擬合方法對所得模型進(jìn)行了擬合，求動力學(xué)模型參數(shù)值。結(jié)果表明，木瓜蛋白酶酶解殼聚糖在初始底物濃度為0.2~0.6 mg/mL范圍內(nèi)，酶解反應(yīng)無底物抑制，在0.6~1.2 mg/mL范圍內(nèi)，酶解反應(yīng)過程出現(xiàn)底物抑制作

3、用，符合底物抑制應(yīng)動力學(xué)模型。該模型理論值與實驗值基本吻合，實驗擬合相對誤差為3.47%(小于10%)。
　　pH值能夠影響木瓜蛋白酶中二級結(jié)構(gòu)的含量，隨著 pH值的增大，酶的有序結(jié)構(gòu)含量增加而無序結(jié)構(gòu)含量減少。木瓜蛋白酶的β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲與酶的活性密切相關(guān)，其酶的活性中心可能是以β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲為主，β-轉(zhuǎn)角含量減少，無規(guī)則卷曲含量增加，有助于酶活提高，反之酶活降低，故 pH值為4.5時得到最大反應(yīng)速率。對不同 pH值下

4、的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán) pK值進(jìn)行分析，可以推測木瓜蛋白酶表現(xiàn)催化活性的必需基團(tuán)可能含有組氨酸殘基。提出同時考慮底物水解和產(chǎn)物抑制作用的反應(yīng)機(jī)理模型，并構(gòu)建該體系的動力學(xué)方程，對所得動力學(xué)模型進(jìn)行擬合，與試驗數(shù)據(jù)吻合度高，由擬合曲線上所得的木瓜蛋白酶水解殼聚糖的最佳 pH值與試驗結(jié)果相符。
　　對不同溫度作用下木瓜蛋白酶的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行 FT-IR分析，通過二階導(dǎo)數(shù)擬合發(fā)現(xiàn)隨溫度增大，木瓜蛋白酶的有序結(jié)構(gòu)含量減少而無序結(jié)構(gòu)含量增加，在45

5、°C時得到最大反應(yīng)速率，說明可能是在該溫度下無規(guī)則卷曲增加，β-轉(zhuǎn)角減少，酶活性中心位結(jié)構(gòu)更具有柔性、更合理，從而使其催化活性提高。求得各熱力學(xué)參數(shù)的值為：A=0.8421，Ea=84.9393 KJ/mol，△?H-19.7575 KJ/mol，△-16.2252 KJ/(mol·K)，A2.3354?；趯Σ煌瑢嶒灄l件下殼聚糖酶水解曲線的分析，并構(gòu)建不同反應(yīng)溫度下的動力學(xué)方程，對所得動力學(xué)模型進(jìn)行擬合，S與試驗數(shù)據(jù)吻合度高，由擬合曲