魚(yú)肉中ATP關(guān)聯(lián)化合物提取方法的改進(jìn)及應(yīng)用.pdf

1、鮮度是水產(chǎn)品重要的品質(zhì)，K值是目前國(guó)內(nèi)外廣泛使用的評(píng)價(jià)魚(yú)貝類的鮮度指標(biāo)。但是至今為止為了測(cè)定K值，HPLC樣品的制備過(guò)程仍然非常繁瑣。本研究在K值測(cè)定原理的基礎(chǔ)上，建立一種改進(jìn)的K值測(cè)定樣品前處理方法，簡(jiǎn)單易行，省時(shí)省力，降低對(duì)儀器的依賴，提高了處理效率，確保測(cè)定精度。基于此方法，以日本比目魚(yú)為材料，研究其不同溫度波動(dòng)下K值及ATP關(guān)聯(lián)化合物的變化。另外，對(duì)杭州市售生鮮魚(yú)的K值進(jìn)行測(cè)定。本論文研究結(jié)果如下：
　　 1建立了一種簡(jiǎn)

2、便、快速地從魚(yú)肉中提取ATP及其關(guān)聯(lián)化合物的定量方法。對(duì)傳統(tǒng)測(cè)定方法中的兩個(gè)步驟進(jìn)行調(diào)整。第一是從魚(yú)肉中提取ATP及其關(guān)聯(lián)化合物。1g魚(yú)肉加到5％ PCA溶液中，以玻璃棒攪碎，一步能夠完全提取ATP及其關(guān)聯(lián)化合物。第二，是以KOH中和PCA的步驟。為了簡(jiǎn)化方法，加入1 M KOH在不去除變性蛋白質(zhì)的情況下中和。結(jié)果表明調(diào)整至pH7會(huì)使少量變性蛋白質(zhì)重新溶解，影響測(cè)定結(jié)果；但是當(dāng)pH調(diào)整至2-3.5時(shí)，通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)蛋白，

3、故可采用1 M KOH調(diào)節(jié)pH至3.0左右。將所得溶液的體積定容到20mL，冰浴靜置30min，上清液過(guò)0.45μm膜除去懸浮顆粒得到濾液。濾液進(jìn)一步用100mM磷酸緩沖液(pH7.5)中和后保存。經(jīng)檢測(cè)，簡(jiǎn)化方法和傳統(tǒng)方法所獲得的ATP及其關(guān)聯(lián)化合物提取量基本相同，證明了本簡(jiǎn)化方法準(zhǔn)確可行。
　　 2測(cè)定ATP在酸性條件下的穩(wěn)定性。0.4mM ATP儲(chǔ)存于1% PCA，室溫下過(guò)夜，以HPLC檢測(cè)，只分解至ADP且分解率為15%

4、。0.4mM ATP在pH1下約為15%，pH3和pH7的分解率均為2%左右，則ATP關(guān)聯(lián)化合物在pH3下室溫過(guò)夜是穩(wěn)定的。另外，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合液調(diào)整至酸性條件，室溫過(guò)夜進(jìn)一步驗(yàn)證了此結(jié)果。ATP在冰浴5% PCA下，經(jīng)過(guò)8小時(shí)，分解率僅3.6%。
　　 3應(yīng)用本文建立的新方法測(cè)定日本比目魚(yú)的K值變化，顯示K值的變化在一定時(shí)期內(nèi)是一級(jí)反應(yīng)，可以建立數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)。變換溫度0℃()10℃和5℃()10℃的儲(chǔ)藏條件下K值的增加傾向于10