IL1Rα-HSA融合蛋白高表達菌株發(fā)酵工藝的優(yōu)化.pdf

1、白介素1受體拮抗劑（IL-1Rα）是具有特異性的天然拮抗劑分子，在臨床上主要用于治療類風濕性關(guān)節(jié)炎，近些年的一些研究結(jié)果表明IL-1Rα對Ⅱ型糖尿病有著明顯的治療效果。但是由于其分子量小，在體內(nèi)的半衰期只有4-6h，不利于臨床上的廣泛應(yīng)用，因此開發(fā)長效的白介素1受體拮抗劑就顯得極為重要。人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）是近幾年來應(yīng)用最為廣泛的延長小分子蛋白半衰期的載體，2014年4月15日，美國FDA批準了

2、英國葛蘭素史克公司用于治療Ⅱ型糖尿病albiglutide注射液（阿必魯泰，商品名:Tanzeum）上市，阿必魯泰是DPPIV耐受的GLP-1和重組HSA的融合蛋白，半衰期可以達到4至7天，適合一周一次甚至每兩周一次的給藥間歇，是世界上首個由FDA批準的HSA融合蛋白的生物藥物，阿必魯泰的上市給更多的HSA融合蛋白藥物上市帶來了新的希望和動力。
　　本研究以pPIC9為表達載體將IL-1Rα基因和HSA基因融合后在畢赤酵母中表達，

3、成功表達得到的融合蛋白IL-1Rα/HSA半衰期較IL-1Rα延長了約20倍，藥代動力學(xué)性質(zhì)得到了明顯的改善。將此單拷貝菌株進行高密度發(fā)酵，融合蛋白表達量只有100 mg/L左右，表達水平較低。無論是從后期臨床研究的需求還是從經(jīng)濟效益考慮都需要提高蛋白的表達水平，我們首先考慮在遺傳水平對宿主進行改造，通過增加目的基因拷貝數(shù)以及與分子伴侶共表達，使融合蛋白在搖瓶水平上的表達量由原來的100 mg/L提高到400 mg/L，提高了約四倍。但

4、是將此高表達菌株進行高密度發(fā)酵時，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)融合蛋白表達水平不但沒有提高，和原始菌株相比表達水平反而降低，而且融合蛋白出現(xiàn)了很嚴重的降解現(xiàn)象。針對這些問題，本實驗主要通過響應(yīng)曲面優(yōu)化方法（Response Surface Methodology）對高表達菌株進行發(fā)酵工藝的優(yōu)化。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴搖瓶及高密度發(fā)酵水平上對培養(yǎng)條件的初步摸索。在高密度發(fā)酵過程中影響蛋白表達的因素很多，如培養(yǎng)基的組成、pH、溫度、甲醇流加方式等

5、，如果將這些因素均在高密度發(fā)酵的水平上進行摸索，試驗周期會很長，因此我們首先在搖瓶水平上進行初步的摸索，確定了pH、溫度以及在工業(yè)培養(yǎng)基中添加一定量的酵母提取物、蛋白胨、生物素、表面活性劑等均為對蛋白的表達有影響的因素。在此基礎(chǔ)上進行高密度發(fā)酵的初步探索，確定了在最佳的培養(yǎng)基添加成分1％酵母提取物、20％溶氧以及較高的甲醇補加速率下蛋白的表達水平有著顯著的提高。通過以上實驗摸索確立發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組成成分以及RSM優(yōu)化的三個因素pH、溫

6、度、甲醇補加速率。⑵響應(yīng)曲面法優(yōu)化OE-Strain表達條件。通過響應(yīng)曲面法進行發(fā)酵工藝的優(yōu)化是目前最常用于發(fā)酵工藝優(yōu)化的方法，響應(yīng)曲面法的優(yōu)點是在試驗條件優(yōu)化過程中可以連續(xù)地對試驗因素的各個水平進行分析，克服了正交試驗只能對一個個孤立的試驗點進行分析和不能給出直觀圖形的缺陷，所以響應(yīng)曲面法被廣泛應(yīng)用于試驗設(shè)計與工藝優(yōu)化研究。通過響應(yīng)面優(yōu)化法確立了最佳的培養(yǎng)條件pH7.0、T=29℃、Vm=4.81mL/L/h，在此最佳的培養(yǎng)條件下，蛋