基于合成生物學(xué)的地雷檢測方法研究.pdf

1、地雷是一種常見的隱蔽性極高的防御性爆炸火器。早在公元1130年就有地雷使用的相關(guān)記錄。19世紀(jì)中葉以后，烈性炸藥2，4，6-三硝基甲苯的發(fā)現(xiàn)，推動了地雷制式化、多樣化的發(fā)展，地雷作為一種廉價、高效的防御武器一直沿用至今。
　　地雷的應(yīng)用對現(xiàn)代戰(zhàn)爭產(chǎn)生了巨大的推動作用，地雷以其高隱蔽性和高殺傷性的優(yōu)勢，使其幾乎受到了歷次現(xiàn)代戰(zhàn)爭的青睞，因此如何在戰(zhàn)場上安全、有效地偵測出地雷埋藏位置，是所有交戰(zhàn)雙方必須解決的問題。此外，地雷對有生力量

2、的殺傷作用并不僅僅在戰(zhàn)爭過程中，地雷的長效性和殺傷性并不隨戰(zhàn)爭的結(jié)束而終結(jié)，許多地雷在戰(zhàn)場上并未引爆或排除，這些遺留地雷至今仍在威脅著當(dāng)?shù)厝嗣竦纳踩Ｒ虼酸槍Φ乩装踩?、有效的偵測方法一直是各國軍事武器專家廣為研究的課題。
　　傳統(tǒng)的地雷檢測方法有生物探測、金屬探測、聲波探測、雷達(dá)探測等，這些傳統(tǒng)的探測手段有一定的局限性。生物探測主要基于動物對于氣味的感官反應(yīng)，由于動物思想不可控制，探測具有很大的不確定性;金屬、聲波和雷達(dá)探測主

3、要基于探測者的主觀判斷，并且大多數(shù)情況下需要身赴雷區(qū)，具有很大的危險性，并且無法針對目前出現(xiàn)的陶瓷、塑料等新型材質(zhì)的地雷進(jìn)行探測。為了解決以上這些問題，基于合成生物學(xué)的地雷檢測方法應(yīng)運(yùn)而生。該方法可依據(jù)地雷的爆炸填充物為靶標(biāo)化合物進(jìn)行檢測，規(guī)避了地雷材質(zhì)的問題。利用細(xì)菌進(jìn)行群體檢測可以有效地避免個體主觀差異對探雷的影響，提高地雷檢測的客觀準(zhǔn)確性，可以與傳統(tǒng)的地雷檢測方法互為補(bǔ)充，進(jìn)而提高地雷檢測的準(zhǔn)確性和安全性。
　　合成生物學(xué)是

4、20世紀(jì)發(fā)展起來的一門基于生命科學(xué)的多學(xué)科交叉新興學(xué)科。目前合成生物學(xué)的研究內(nèi)容主要可以分為以下三個層次:一是對自然界已知功能的生物元件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)計，進(jìn)而形成模塊，根據(jù)工程學(xué)思想，自下而上進(jìn)行逐級組裝，構(gòu)建出具有全新功能的基因線路或生命系統(tǒng);二是隨著基因合成技術(shù)的發(fā)展，通過人工設(shè)計、合成、組裝新的生命體基因組，實(shí)現(xiàn)生命體的重構(gòu);第三個層次建立在前兩個層次的基礎(chǔ)上，創(chuàng)造完整的全新生物系統(tǒng)，乃至人工生命體。
　　生物傳感器的構(gòu)建系基

5、于合成生物學(xué)研究內(nèi)容的第一層次，通過挖掘自然界中對靶標(biāo)化合物敏感的感應(yīng)元件與適于體現(xiàn)感應(yīng)強(qiáng)度的報告元件進(jìn)行組裝，通過對報告元件所產(chǎn)生信號的讀取分析，感應(yīng)出靶標(biāo)化合物的濃度、位置等信息。
　　本研究擬構(gòu)建的地雷探測生物傳感器也主要由感應(yīng)元件和報告元件構(gòu)成，目前生物傳感器報告元件的發(fā)展已經(jīng)比較成熟，主要有l(wèi)uxCDABE、GFP、lacZ等。研究主要以地雷的常規(guī)爆炸裝填物2，4，6-Trinitrotoluene(TNT)為靶標(biāo)分子，

6、挖掘自然界存在的感應(yīng)元件，并對其進(jìn)行一系列分析和改造以提高感應(yīng)活性，或通過自然界中已有報道的一些可感應(yīng)TNT的調(diào)控線路，構(gòu)建基因傳感線路，最后圍繞合成生物學(xué)生物傳感器的構(gòu)建，搭建可用于細(xì)菌自裂解的基因模塊，以期實(shí)現(xiàn)完整生物傳感器的構(gòu)建。
　　研究內(nèi)容主要分為以下幾個方面:
　　(1)天然TNT感應(yīng)元件發(fā)掘
　　選擇實(shí)驗(yàn)室遺傳操作最為明晰的大腸桿菌入手，進(jìn)行大腸桿菌的TNT天然感應(yīng)元件挖掘。為了便于啟動子文庫的構(gòu)建與篩選

7、，首先構(gòu)建了一個可用于啟動子篩選的載體pTJH629，向載體中引入了大腸桿菌低拷貝復(fù)制子pSC101 ori。
　　通過提取純化E.coli K-12 MG1655基因組，并利用SA U3AI內(nèi)切酶對其完全酶切，以luxCDABE化學(xué)發(fā)光為報告手段構(gòu)建大腸桿菌基因組天然啟動子文庫，經(jīng)過高低濃度TNT的兩輪篩選，在文庫中得到具有一定特異性和靈敏度的5個啟動元件，并對5個啟動元件進(jìn)行特異性、靈敏度、時效性分析，發(fā)現(xiàn)其具有較好的啟動活性

8、。
　　通過對5個元件基因序列的進(jìn)一步分析，在大腸桿菌基因組中比對得到相應(yīng)位置序列信息，通過數(shù)據(jù)庫比對以及啟動子在線預(yù)測等方法，得到了各個元件序列中可能存在的啟動序列。接著利用體外直接退火擴(kuò)增的方法，得到這些序列，并針對啟動元件對TNT的敏感性進(jìn)行研究，以對元件的最小功能序列進(jìn)行確證，最后確證了其中兩個元件發(fā)揮功能的最小序列topAp4和recEA4。
　　(2)基于應(yīng)激損傷機(jī)制的人工啟動子文庫構(gòu)建與篩選
　　通過上一

9、步中對大腸桿菌基因組中啟動元件的篩選發(fā)現(xiàn)，topA和recEA4均屬于細(xì)菌SOS家族成員，同時結(jié)合文獻(xiàn)調(diào)研，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌應(yīng)急損傷家族可以受到TNT的誘導(dǎo)反應(yīng)。因此進(jìn)一步對SOS家族的基因啟動子進(jìn)行了考察，從中得到了幾個對TNT有明顯誘導(dǎo)反應(yīng)的啟動子。通過對篩選得到的SOS啟動元件進(jìn)行序列分析，從其中序列共性較多的啟動子(sulA、recA、umuDC)著手，對其序列的保守區(qū)進(jìn)行提取，對其可變區(qū)進(jìn)行完全隨機(jī)突變，構(gòu)建SOS啟動子的隨機(jī)突變文庫

10、。在文庫中對TNT感應(yīng)情況進(jìn)行考察，從中篩選出了5個可受TNT調(diào)控的全新的SOS啟動子，通過對啟動特性的考察，發(fā)現(xiàn)其在保證特異性、時效性等特性的基礎(chǔ)上其靈敏度較野生型SOS啟動子都有顯著提升。
　　(3)惡臭假單胞菌XylR5-Pu-GFP測線路構(gòu)建
　　惡臭假單胞菌mt-2能夠以甲苯硝基衍生化合物中的硝基作為氮源進(jìn)行生理代謝，因此惡臭假單胞菌中肯定存在可受TNT誘導(dǎo)的調(diào)控元件，根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)其發(fā)揮功能的關(guān)鍵元件為TOL質(zhì)

11、粒上的XylR-Pu線路。XylR蛋白作為惡臭假單胞菌甲苯代謝通路中的關(guān)鍵調(diào)控因子，可受甲苯及其衍生化合物的調(diào)控反應(yīng)，激活上游的Pu啟動子，根據(jù)此調(diào)控原理，以文獻(xiàn)報道的對2,4-Dinitrotoluene（2，4-DNT）特異的XylR突變體XylR5為調(diào)控因子，以GFP為報告基因，構(gòu)建了XylR-Pu-GFP基因調(diào)控線路。利用重組工程方法將線路整合到假單胞菌基因組上，并通過Cre-loxP實(shí)現(xiàn)了構(gòu)建過程中抗性基因的敲除，實(shí)現(xiàn)了生物傳

12、感器基因工程菌的菌株構(gòu)建。同時搭建了一個質(zhì)粒平臺pSN129，可通過對平臺上的元件進(jìn)行替換，實(shí)現(xiàn)線路功能的轉(zhuǎn)換。
　　(4)可受阿拉伯糖誘導(dǎo)的細(xì)菌自裂解模塊構(gòu)建
　　為了實(shí)現(xiàn)基因工程菌對環(huán)境的無污染、無殘留，本研究還開展了對生物傳感器的檢測后自毀模式的研究。通過文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)了T4噬菌體的穿孔素蛋白Holin與T4溶菌酶的配合使用可調(diào)控實(shí)現(xiàn)細(xì)菌自殺，以此為基礎(chǔ)設(shè)計構(gòu)建了pBAD-Holin-Lysozyme-AntiHolin

13、的自殺線路，通過引入Holin拮抗蛋白AntiHolin的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)了含有自殺表達(dá)模塊的菌株的正常生長，同時通過替換AntiHolin的啟動子，實(shí)現(xiàn)其不同強(qiáng)度的表達(dá)，也可使自殺的起效時間、自殺強(qiáng)度高低得到一定控制。
　　綜上所述，在本研究中以大腸桿菌基因組為模板，構(gòu)建了基因組天然啟動子文庫，從中篩選得到了5個可受TNT誘導(dǎo)的天然啟動子元件，其啟動活性均達(dá)到或超過了國際上報道的元件的領(lǐng)先水平;結(jié)合篩選結(jié)果與文獻(xiàn)調(diào)研，通過對大腸桿菌S

14、OS應(yīng)激損傷系統(tǒng)的啟動子篩查，得到了幾個可受TNT調(diào)控的SOS啟動子，通過對其進(jìn)行序列分析，設(shè)計了一個SOS啟動子的隨機(jī)突變文庫，并在文庫中篩選得到了5個全新的SOS啟動元件，并且其靈敏度較同類元件有顯著提高;通過對假單胞菌天然元件XylR-Pu的應(yīng)用，構(gòu)建了XylR5-Pu-GFP基因工程菌，并實(shí)現(xiàn)了基因組引入抗性的剔除，并且構(gòu)建了一個基因線路平臺pSN129，可便捷的替換元件改變功能;通過對T4噬菌體Holin蛋白與穿孔素蛋白作用原