RNAi介導(dǎo)的NMPT基因表達(dá)抑制對(duì)胰島素抵抗與動(dòng)脈粥樣硬化的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:RNAi介導(dǎo)的NAMPT基因表達(dá)抑制對(duì)C57BL/6J小鼠糖脂代謝及胰島素抵抗的影響
　　目的:探討NAMPT基因表達(dá)抑制對(duì)C57BL/6J小鼠糖脂代謝及胰島素抵抗的影響。
　　方法:40只健康雄性的C57BL/6J小鼠，鼠齡7周，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為普食喂養(yǎng)組(NF組，n=10)，高脂喂養(yǎng)組（HF組，n=10）;高脂+pAd-GFP組（GFP組，n=10），高脂+pAd-shNAMPT組(shNAMPT組，n

2、=10)，均喂養(yǎng)12周。于11W末分別給予GFP和shNAMPT組小鼠尾靜脈注射pAd-GFP或pAd-shNAMPT。3d后行頸動(dòng)靜脈導(dǎo)管置入術(shù)，術(shù)后各組小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3天。采用擴(kuò)展高胰島素正葡萄糖鉗夾術(shù)（示蹤劑為3-3H標(biāo)志的葡萄糖）評(píng)價(jià)糖脂代謝及胰島素抵抗變化。
　　結(jié)果:HF組、GFP組和shNAMPT組肝臟組織NAMPT mRNA和蛋白表達(dá)及血漿NAMPT蛋白表達(dá)均較NF組明顯降低（均P＜0.01），且shNAMPT組肝

3、臟組織NAMPT mRNA和蛋白表達(dá)及血漿NAMPT蛋白表達(dá)明顯低于HF組和GFP組（均P＜0.01）。三組高脂喂養(yǎng)的C57BL/6J小鼠體重、空腹血糖(FBG)、血漿胰島素(Fins)、血漿甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、和肝臟TC、 TG水平均明顯高于NF組，（均P＜0.01），而shNAMPT組與HF組和GFP組比較，HDL-C和Fins水平增高(P＜0.05或P＜0.0

4、1)，肝臟TC明顯降低(P＜0.05)。鉗夾穩(wěn)態(tài)時(shí)，shNAMPT組HDL-C雖被抑制，但仍明顯高于NF組、HF組和GFP組（均P＜0.01）。在相同的高胰島素輸注下，NF組的葡萄糖輸注率(GIR)明顯高于HF組、GFP組和shNAMPT組（均P＜0.01），shNAMPT組的GIR與HF組和GFP組相比雖輕度降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鉗夾結(jié)束時(shí)，三組高脂喂養(yǎng)小鼠的葡萄糖清除率(GRd)明顯低于NF組（均P＜0.01），而肝糖輸出率(H

5、GP)明顯高于NF組(均P＜0.01); shNAMPT組的GRd輕度低于HF組和GFP組，其HGP輕度高于HF組和GFP組，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。
　　結(jié)論:高脂飲食喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠可誘導(dǎo)類似人類T2DM生理特點(diǎn)的胰島素抵抗模型。NAMPT基因抑制對(duì)高脂誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠產(chǎn)生的胰島素抵抗無影響。
　　第二部分:RNAi介導(dǎo)的NAMPT基因表達(dá)抑制對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響及機(jī)制研究
　　第一節(jié):

6、NAMPT基因表達(dá)抑制對(duì)ApoE-/-小鼠脂代謝和動(dòng)脈粥樣硬化的影響
　　目的:探討NAMPT基因表達(dá)抑制對(duì)ApoE-/-小鼠脂代謝及動(dòng)脈粥樣硬化的影響
　　方法:48只雄性的ApoE-/-小鼠，鼠齡7周，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為高脂喂養(yǎng)+PBS組（PBS組，n=10），高脂+pAd-GFP組(GFP-A組，n=10)和高脂+pAd-shNAMPT組(NAMPT-A組，n=10)，均喂養(yǎng)12周。PBS組、GFP-A組和NAM

7、PT-A組于高脂喂養(yǎng)的第8周末和10周末分別給予尾靜脈注射PBS、Ad-GFP或Ad-shNAMPT。RT-PCR和western blot檢測(cè)NAMPT的基因及蛋白表達(dá)。酶法檢測(cè)各組小鼠血脂和肝臟脂質(zhì)。用HE檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈竇部的斑塊面積;用油紅O和天狼星紅苦味酸染色分別檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈竇部斑塊中的脂質(zhì)和膠原含量;用油紅O染色法檢測(cè)小鼠降主動(dòng)脈的中性脂肪含量。
　　結(jié)果:NAMPT-A組肝臟組織NAMPTmRNA和蛋白表達(dá)水平及血漿

8、NAMPT蛋白表達(dá)均明顯低于PBS組和GFP-A組（均P＜0.01）。NAMPT-A組血漿HDL-C水平明顯高于PBS組和GFP-A組，而肝臟組織的TC低于PBS組和GFP-A組（均P＜0.01或P＜0.05）。與PBS組和GFP-A組相比，NAMPT-A組主動(dòng)脈竇部的斑塊面積和中性脂肪含量明顯降低，而斑塊中的膠原含量明顯升高(均P＜0.01)。NAMPT-A組降主動(dòng)脈的中性脂肪含量明顯低于PBS組和GFP-A組(均P＜0.01)。

9、r>　　結(jié)論:NAMPT基因表達(dá)抑制能明顯減少斑塊面積，增加斑塊纖維化，使斑塊趨于更穩(wěn)定的表型。NAMPT基因表達(dá)抑制可能具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。
　　第二節(jié):NAMPT基因表達(dá)抑制對(duì)ApoE-/-小鼠巨噬細(xì)胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的體內(nèi)研究
　　目的:探討NAMPT基因表達(dá)抑制對(duì)ApoE-/-小鼠巨噬細(xì)胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)的影響及機(jī)制研究
　　方法24只雄性的ApoE-/-小鼠，鼠齡7周，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為高脂喂養(yǎng)+PBS組

10、（PBS組，n=8），高脂+pAd-shGFP組(GFP-A組，n=8)和高脂+pAd-shNAMPT組(NAMPT-A組，n=16)，均喂養(yǎng)12周。PBS組、GFP-A組和NAMPT-A組于高脂喂養(yǎng)的第8周末和10周末分別給予尾靜脈注射PBS、Ad-GFP或Ad-shNAMPT。于第12周腹腔注射經(jīng)ac-LDL和3H-cholesterol處理過的RAW264.7巨噬細(xì)胞懸液(0.5ml/鼠，細(xì)胞數(shù)達(dá)4.5×106，放射活性6.4×1

11、06cpm)?？焖俚鞍滓合嗌V法分離血漿脂蛋白及酶法檢測(cè)膽固醇含量。液體閃爍計(jì)數(shù)法測(cè)定小鼠血漿、肝組織及糞便的3H含量。RT-PCR和western blot檢測(cè)肝臟的NAMPT、PPARα、LXRα、ABCA1及ABCG1的基因及蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:FPLC及酶法分析顯示NAMPT-A組小鼠血漿HDL(峰值26-31)中的膽固醇含量高于PBS組和GFP-A組。NAMPT-A組小鼠6h、24h及48h血漿3H含量較PBS組和GF

12、P-A組顯著增多，占注射總量的百分比分別為（6h1.46±0.36 VS1.11±0.22，1.10±0.23），(24h5.01±0.83 VS3.5±0.44,3.55±0.62),(48h5.26±0.95 VS3.79±0.75,3.81±0.88)，(P＜0.05或P＜0.01)。NAMPT-A組小鼠肝臟3H含量較PBS組和GFP-A組顯著增多(6.88±0.79 VS3.88±0.72，3.92±0.73)，（均P＜0.05

13、），糞便的3H含量顯著增多(9.85±2.01 VS6.29±1.26，6.31±1.32)，（均P＜0.05）。與PBS組和GFP-A組相比，NAMPT-A組小鼠肝臟的PPARα、LXRα、ABCA1及ABCG1基因和蛋白表達(dá)均明顯升高（均P＜0.01）。
　　結(jié)論:NAMPT基因表達(dá)抑制可能通過上調(diào)肝臟PPARα、LXRα、ABCA1及ABCG1基因的表達(dá)，促進(jìn)小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　第三節(jié):MK866介導(dǎo)

14、的NAMPT基因表達(dá)抑制對(duì)細(xì)胞膽固醇流出的分子機(jī)制研究
　　目的:探討NAMPT基因表達(dá)抑制對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞膽固醇流出的影響及機(jī)制研究
　　方法:(1)用Ad-GFP或Ad-shNAMPT干預(yù)3H-cholesterol標(biāo)記的巨噬細(xì)胞，然后用含有HDL的培養(yǎng)基孵育，LSC法測(cè)定細(xì)胞膽固醇流出;(2)以Ad-GFP或Ad-shNAMPT干預(yù)RAW巨噬細(xì)胞和Hepa1-6肝細(xì)胞，然后用MK866（PPARα抑制劑）干預(yù)。酶法測(cè)定細(xì)

15、胞內(nèi)的TC含量。RT-PCR和western blot檢測(cè)兩種細(xì)胞NAMPT、PPARα、LXRα、ABCA1及ABCG1的基因和蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:1.與Ad-GFP相比，Ad-shNAMPT干預(yù)后巨噬細(xì)胞和肝臟細(xì)胞NAMPT基因及蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。2.Ad-shNAMPT干預(yù)明顯促進(jìn)體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞的膽固醇流出(P＜0.01)。3.與Ad-GFP相比，Ad-shNAMPT干預(yù)降低RAW和Hepa1-6細(xì)胞