2型糖尿病高糖、高胰島素對(duì)人和小鼠胰腺星狀細(xì)胞功能和增殖的影響.pdf

1、流行病學(xué)研究提示:肥胖、糖尿病與胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma，PDAC)的發(fā)生存在緊密聯(lián)系。一項(xiàng)Meta分析顯示，按2型糖尿病(type2diabetes mellitus，T2DM)患者不同病程1年、1-4年、5-9年、10年以上分析，患PDAC的相對(duì)危險(xiǎn)度(relative risk，RR)分別為5.38、1.95、1.49、1.47。T2DM是一組由胰島素抵抗引起胰島β細(xì)胞過(guò)度分泌胰島素導(dǎo)致的以高血糖

2、和高胰島素血癥為主要特征的臨床癥候群。T2DM導(dǎo)致PDAC的機(jī)制尚不完全清楚，目前針對(duì)胰島素在PDAC發(fā)生發(fā)展中作用的研究主要集中在其對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖及存活效率方面的影響，而對(duì)胰腺基質(zhì)細(xì)胞的影響關(guān)注甚少。胰腺纖維化是PDAC的病理特征之一，其中負(fù)責(zé)產(chǎn)生大量纖維基質(zhì)反應(yīng)的是活化的胰腺星狀細(xì)胞(pancreatic stellate cell，PaSC)。我們的前期研究表明，高脂飲食誘導(dǎo)的Kras基因突變的PDAC小鼠模型體內(nèi)可見(jiàn)血糖和胰島

3、素水平明顯增高以及胰腺組織中大量活化的PaSC。本研究主要探討高濃度的胰島素和葡萄糖對(duì)人和小鼠PaSC活化、增殖和促纖維化反應(yīng)方面的影響及其相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)通路。
　　第一部分、2型糖尿病患者及高脂喂養(yǎng)小鼠胰腺中存在活化的胰腺星狀細(xì)胞及大量膠原蛋白沉積
　　目的:明確T2DM患者及高脂喂養(yǎng)小鼠胰腺纖維化的程度以及PaSC的分布及活化情況。
　　方法:(1)收集非糖尿病和T2DM患者捐贈(zèng)的胰腺組織各3例（女性，年齡范圍:52

4、-57歲），經(jīng)4％多聚甲醛固定，石蠟包埋(formalin-fixed，paraffin-embedded，F(xiàn)FPE)后行4μm連續(xù)切片。石蠟切片行馬松染色(Masson'sstaining)和免疫熒光雙標(biāo)染色(PaSC marker/α-SMA，pancreaticβ cellmarker/insulin)，觀察T2DM患者胰腺組織中膠原蛋白(Collagen，Col)沉積以及PaSC的分布，評(píng)估T2DM患者胰腺纖維化和PaSC活化情

5、況。(2)選取6周齡雌性C57BL/6小鼠共40只，隨機(jī)分為兩組:普通飼料(control diet，CD)飼養(yǎng)的對(duì)照組和高脂、高熱量飼料(high fat，high calorie，HFCD)飼養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組，每組各20只，再分為四亞組，每亞組各5只，分別飼養(yǎng)3、6、9和12月后取各組小鼠的胰腺組織制備4μm的石蠟切片，行天狼星紅(sirius red)染色及免疫熒光雙標(biāo)染色(PaSC marker/α-SMA，pancreaticβ c

6、ell marker/insulin)，評(píng)估HFCD喂養(yǎng)小鼠胰腺纖維化的程度以及PaSC活化情況。
　　結(jié)果:(1) Masson's染色結(jié)果顯示:非糖尿病患者的胰腺形態(tài)正常，膠原纖維主要局限分布在血管周?chē)Ｅc非糖尿病患者相比，T2DM患者胰腺中可見(jiàn)大量藍(lán)色膠原纖維，且不僅在血管周?chē)?，在胰島內(nèi)以及胰島周?chē)梢?jiàn)大量膠原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ，ColⅠ)沉積，T2DM患者胰腺組織膠原蛋白沉積的量約是非糖尿病患者的3倍;免疫熒光染

7、色結(jié)果顯示:非糖尿病患者胰腺中PaSC活化標(biāo)志物α-SMA+細(xì)胞較少，且主要局限在血管周?chē)?，但T2DM患者胰腺中α-SMA+細(xì)胞較對(duì)照組明顯增加，且主要分布在insulin+的胰島β細(xì)胞周?chē)?2) Sirius red染色結(jié)果顯示:HFCD喂養(yǎng)12月的小鼠胰腺出現(xiàn)輕微的纖維化和胰島細(xì)胞肥大，與對(duì)照組小鼠胰腺組織中膠原蛋白多沉積于血管周?chē)煌?，HFCD組小鼠胰島及鄰近腺泡細(xì)胞周?chē)梢?jiàn)大量ColⅠ沉積。且胰腺組織ColⅠ沉積量也隨HFC

8、D喂養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)而明顯增加。同期的免疫熒光染色也得到了與Sirius red一致的結(jié)果，HFCD喂養(yǎng)小鼠的胰島內(nèi)存在大量α-SMA+的活化PaSC。
　　結(jié)論:本課題首次在T2DM患者和HFCD肥胖小鼠模型的胰腺中發(fā)現(xiàn)活化的PaSC，為“T2DM和肥胖為PaSC活化和纖維基質(zhì)反應(yīng)提供微環(huán)境”的假說(shuō)提供了新證據(jù)，也為后續(xù)進(jìn)一步研究高糖、高胰島素的T2DM環(huán)境對(duì)PaSC活化、增殖和功能等生物學(xué)特性的影響及其相關(guān)信號(hào)通路提供了依據(jù)。

9、r>　　第二部分、人和小鼠胰腺星狀細(xì)胞的分離鑒定以及高糖、高胰島素對(duì)胰腺星狀細(xì)胞活化、增殖和功能的影響
　　目的：分離、培養(yǎng)并鑒定小鼠原代PaSC。觀察PaSC卜胰島素受體的表達(dá)情況。觀察高濃度胰島素與高糖對(duì)PaSC活化、增殖及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellubr matrix，ECM)合成等生物學(xué)特性的影響及其相關(guān)信弓傳導(dǎo)通路。
　　方法：(1)取人及小鼠新鮮胰腺組織用于PaSC細(xì)胞的分離。對(duì)傳代培養(yǎng)的第二代PaSC行免疫

10、熒光染色，鑒定PaSC特征性標(biāo)志物(α-SMA，Desmin，Vimentin)，ECM蛋白成分[collagenⅠ，collagen Ⅲ，纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)]。(2)用新鮮分離的小鼠原代胰腺星狀細(xì)胞(mouse primarypancreatic stellate cell，mPaSC)行蛋白印跡試驗(yàn)(western blot，WB)及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time P

11、CR，qPCR)檢測(cè)明確PaSC上胰島素受體(insulin receptog IR)和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體(insulin-like growthf actorr eceptor，IGF-1R)的表達(dá)。(3)qPCR檢測(cè)高濃度胰島素在高糖環(huán)境下對(duì)PaSC活化的影響。(4)WB檢測(cè)高濃度胰島素單獨(dú)或聯(lián)合高糖對(duì)PaSC上IR／IGF-1R的激活以及下游信號(hào)分子(AKT，mTOR，P70S6K，ERK，JNK)的活性。(5)qPCR和M

12、TT法分別檢測(cè)高濃度胰島素單獨(dú)或與高糖聯(lián)合作用對(duì)己活化PaSC增殖及ECM蛋向合成的影響。
　　結(jié)果：(1)免疫熒光染色鑒定分離得到的PaSC，傳代后胞內(nèi)脂質(zhì)消失，表達(dá)星狀細(xì)胞標(biāo)記物0c-SMA，Nestin，Vimentin，并高表達(dá)ECM(collagen I，collagen Ⅲ，fibronectin)。(2)蛋白印跡實(shí)驗(yàn)及qPCR結(jié)果均證實(shí)PaSC同時(shí)高表達(dá)IR(主要表達(dá)IR-A亞型)和IGF-1R受體，且IR和IG-1

13、R的表達(dá)量在PaSC靜息和活化狀態(tài)下無(wú)明顯差異。以不同胰島素濃度(25～100nM)刺激PaSC，24h可見(jiàn)IR和IGF-1R水平均隨胰島素濃度梯度升高而明顯下調(diào)，48h恢復(fù)至對(duì)照組水平。(3)qPCR結(jié)果顯示：與10％FBS的陽(yáng)性對(duì)照相比，高糖、高胰島素作用下的PaSC并未出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量和α-SMA+細(xì)胞的增多，提示高濃度胰島素對(duì)PaSC活化無(wú)明顯影響。但在高胰島素的刺激下，己活化的PaSC合成Col和FN等ECM蛋白的能力明顯高于對(duì)照

14、組[Col：(1.61±0.12) vs.(1.000±0.03)，P＜0.05；FN：(1.72±O.04) vs.(1.000±0.06)，P＜O.05]。(4)WB表明，不同濃度梯度的胰島素可誘導(dǎo)PaSC表面IR/IGF-1R的磷酸化，且100nM的胰島素誘導(dǎo)的IR/IGF-1R磷酸化水平最強(qiáng)，為對(duì)照組的7.4倍(p＜O.05)。IR/IGF-1R的磷酸化還可導(dǎo)致下游MAPK／ERK和AKT/mTOR信號(hào)通路的激活。與ERK1/2

15、和SAPK/JNK在高濃度胰島素處理后出現(xiàn)的快速而短暫的磷酸化水平增加相比，AKT/mTOR路的激活強(qiáng)效而持久。此外，胰島素單獨(dú)或與高糖聯(lián)合作用于PaSC1、3、6和24h，均可引起IR/IGF-1R，AKT，P70S6K，ERK1/2不同程度的蛋白磷酸化水平升高，且與高糖聯(lián)合作用下，上述蛋白的磷酸化水平升高更為明顯。(5)已活化的PaSC受高糖、高胰島素單獨(dú)或聯(lián)合作用刺激48h，qPCR結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，高糖、高胰島素均可一定程

16、度地提高PaSC合成ECM蛋白的能力，F(xiàn)N和ColⅠ的mRNA水平較對(duì)照組明顯升高，且高糖，高胰島素聯(lián)合作用的增強(qiáng)效果更明顯[FN：(1.85±0.10) w.(1.000±O.13)，P＜0.05；Col：(1.74±0.08) vs.(1.000±0.07)，P＜0.05]。但無(wú)論是高糖亦或是高胰島素對(duì)α-SMA的mRNA水平均無(wú)明顯影響。MTT結(jié)果顯示：高糖、高胰島素單獨(dú)刺激72h，PaSC細(xì)胞增殖的數(shù)量是對(duì)照組的1.8倍(p＜0

17、.05)，而兩者聯(lián)合作用下的細(xì)胞增殖量是對(duì)照組的2.7倍(p＜O.05)。
　　結(jié)論：PaSC高表達(dá)IR和IGF-1R受體，且兩者的表達(dá)量在PaSC靜息和活化狀態(tài)下無(wú)明顯差異。高濃度的胰島素可與IR/IGF-1R結(jié)合，使受體磷酸化，并激活下游AKT/mTOR和MAPK/ERK兩條重要信號(hào)通路，促進(jìn)已活化PaSC細(xì)胞的增殖和合成ECM蛋白的能力，但無(wú)論是高濃度的胰島素還是高糖對(duì)PaSC的活化無(wú)明顯影響。
　　第三部分、mTOR

18、通路阻斷劑(KU63794)對(duì)胰島素誘導(dǎo)的胰腺星狀細(xì)胞功能和增殖的影響
　　目的：在第二部分實(shí)驗(yàn)中，我們已觀察到胰島素能夠誘導(dǎo)PaSC表面IR/IGF-1R受體磷酸化以及AKT/mTOR和MAPK/ERK重要信號(hào)通路的激活。且胰島素對(duì)AKT/mTOR信號(hào)通路的激活比MAPK／ERK更為持久和顯著，為了進(jìn)一步闡述AKT/mTOR信號(hào)通路在胰島素誘導(dǎo)的PaSC增殖和促纖維化反應(yīng)中的作用，我們選擇roTOR復(fù)合物1(mTORcomple

19、x 1，mTORCl)和mTOR復(fù)合物2(mTOR complex 2，mTORC2)的小分子選擇性阻斷劑KU63794(KU)，觀察其對(duì)AKT/mTOR信號(hào)通路以及PaSC增殖與合成ECM相關(guān)蛋白的影響，并分析相關(guān)的分子機(jī)制。
　　方法：小鼠胰腺星狀細(xì)胞細(xì)胞系(immortalizedm ouse PaSC，imPaSC)分別用mTOR阻斷劑KU(1μM)或新鮮的無(wú)血清培養(yǎng)基預(yù)處理1h，(1)用胰島素(100nM)干預(yù)15min

20、-48h，通過(guò)WB分析KU對(duì)imPaSC下游信號(hào)通路活性的影響。(2)用胰島素(100nM)干預(yù)48h，通過(guò)WB檢測(cè)KU對(duì)imPaSC合成ECM蛋白能力的影響。(3)用胰島素(100nM)干預(yù)48h或96h，通過(guò)MTT法檢測(cè)KU對(duì)imPaSC增殖能力的影響。
　　結(jié)果：(1)WB結(jié)果表明，以1μM KU阻斷mTOR通路，能夠完全抑制imPaSC由胰島素誘導(dǎo)的P70S6K蛋白在Thr389位點(diǎn)的磷酸化，且這種抑制作用可持續(xù)至少48h

21、，同時(shí)能顯著降低AKT在Ser473的磷酸化水平。但p-ERK1/2與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化。(2)WB結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，KU(1μM)預(yù)處理imPaSC，能夠幾乎完全抑制胰島素誘導(dǎo)的FN，ColⅠ以及4-羥化酶α2(the alpha subunit 2 of prolyl 4-hydroxylase，P4HA2)蛋白水平的增加(p＜0.05)。與此相反的是，無(wú)論是高濃度的胰島素(100nM)還是KU(1μM)對(duì)PaSC活化標(biāo)志物