面包酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)對(duì)中國(guó)鹵蟲(Artemia sinica)抗弧菌感染的影響與酚氧化酶原在鹵蟲早期發(fā)育過(guò)程中表達(dá)時(shí)相的研究.pdf

1、鹵蟲又名鹽水豐年蟲,隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門,甲殼綱,具有廣溫、耐高鹽等特性,因其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高,且其休眠卵便于保存,運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)成為海水養(yǎng)殖業(yè)中非常重要的餌料生物。近年來(lái),在甲殼動(dòng)物疾病感染機(jī)制、生物體抗性反應(yīng)機(jī)制和餌料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值分析等方面被作為一種極好的模式生物進(jìn)行了的相關(guān)研究。與其他無(wú)脊椎動(dòng)物類似,鹵蟲缺乏特異性免疫系統(tǒng),沒(méi)有免疫記憶能力,只能依靠非特異性免疫反應(yīng)來(lái)抵御病原菌侵染,其中,由酚氧化酶原激活系統(tǒng)、溶酶體酶(含溶菌酶)和抗氧化酶類(含

2、超氧化物歧化酶)等構(gòu)成的體液免疫反應(yīng),在其免疫防御中發(fā)揮著十分重要的作用,其中,酚氧化酶、溶菌酶和超氧化物歧化酶己被用作評(píng)價(jià)甲殼動(dòng)物免疫力的指標(biāo)之一。
　　 近年來(lái),甲殼動(dòng)物如蝦、蟹等的養(yǎng)殖病害的發(fā)生日趨嚴(yán)重,其中,細(xì)菌類疾病中由弧菌引起的養(yǎng)殖動(dòng)物的致死率最高,使養(yǎng)殖業(yè)遭受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失,已成為阻礙水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的限制性因素。使用化學(xué)藥物進(jìn)行防治的方法,因易造成環(huán)境污染、藥物殘留、危害人體健康等問(wèn)題,其應(yīng)用已受到了嚴(yán)格的限

3、制。開(kāi)拓新的有效的病害防治方法,變得尤為迫切。通過(guò)研究甲殼動(dòng)物的免疫機(jī)制,提高甲殼動(dòng)物免疫力,從而增強(qiáng)其抗病力的途徑被認(rèn)為是解決養(yǎng)殖甲殼動(dòng)物疾病爆發(fā)的關(guān)鍵。
　　 本文比較研究了野生型(WT)面包酵母菌(SC)和其細(xì)胞壁同源突變型(mnn9)兩種SC酵母菌株作為鹵蟲餌料,對(duì)鹵蟲抗弧菌VC感染的免疫機(jī)制的影響作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),分別投喂鹵蟲WT和mnn9,于培養(yǎng)兩天后,兩組鹵蟲的存活率出現(xiàn)顯著性差異,同時(shí),對(duì)其進(jìn)行VC侵染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),于

4、侵染24h時(shí),兩組之間也出現(xiàn)顯著性差異,而且均是投喂mnn9的鹵蟲明顯高于投喂WT的鹵蟲,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),這種差異越來(lái)越大。對(duì)培養(yǎng)至第三天時(shí)投喂WT或mnn9的鹵蟲體長(zhǎng)分別進(jìn)行了測(cè)定發(fā)現(xiàn),投喂mnn9的鹵蟲體長(zhǎng)明顯大于投喂WT的鹵蟲。另外,又對(duì)投喂WT和mnn9的鹵蟲的PO、SOD和LSZ活性變化進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)于侵染后不同時(shí)間,投喂mnn9的鹵蟲的三種免疫酶活性均明顯高于投喂WT的鹵蟲。在無(wú)弧菌侵染的情況下,得到了與此相一致的結(jié)論

5、。分析認(rèn)為,mnn9相對(duì)于WT,對(duì)鹵蟲具有更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,并且其細(xì)胞壁突變使其成分發(fā)生變化,β-葡聚糖及幾丁質(zhì)含量均高于WT酵母菌,因此推測(cè),mnn9首先可以通過(guò)營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化增強(qiáng)鹵蟲體質(zhì),又可以通過(guò)細(xì)胞壁免疫刺激成份如β-葡聚糖和幾丁質(zhì)形成對(duì)鹵蟲非特異性免疫系統(tǒng)持續(xù)有益的刺激,從而提高鹵蟲的免疫酶活性表達(dá)水平,增強(qiáng)其抗VC感染的免疫力,進(jìn)而提高了存活率。
　　 弧菌VC對(duì)鹵蟲進(jìn)行侵染后發(fā)現(xiàn),于侵染后24h時(shí),投喂WT的鹵蟲的存活率明

6、顯降低,并隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng),急劇下降。對(duì)其PO、SOD和LSZ活性的檢測(cè)同樣發(fā)現(xiàn),三種免疫酶活性也均于侵染后不同時(shí)間出現(xiàn)了顯著性下降。說(shuō)明弧菌VC侵染導(dǎo)致了鹵蟲先天性免疫系統(tǒng)受損,從而降低了相關(guān)的免疫酶活性,引起鹵蟲存活率降低。
　　 WT或mnn9經(jīng)熱激誘導(dǎo)后,蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示其熱激蛋白Hsp70的表達(dá)量增多,投喂鹵蟲熱激WT后發(fā)現(xiàn),于侵染后48h-72h時(shí),其存活率比投喂正常培養(yǎng)WT的鹵蟲的明顯更高。對(duì)其PO、SOD和

7、LSZ三種免疫相關(guān)酶活性的檢測(cè)同樣發(fā)現(xiàn),投喂熱激WT的鹵蟲具有更高的酶活性。因此分析認(rèn)為,酵母菌熱激后熱激蛋白的增多可能是導(dǎo)致鹵蟲免疫系統(tǒng)增強(qiáng)的主要因素,通過(guò)某種仍然未知的機(jī)制,刺激了鹵蟲的非特異性免疫系統(tǒng),使其免疫酶活性水平增高,最終提高了鹵蟲抗感染的能力,使存活率升高。
　　 本文利用已知美國(guó)鹵蟲的酚氧化酶原cDNA序列全長(zhǎng)設(shè)計(jì)引物,利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法,克隆并拼接獲得了中國(guó)鹵蟲proPO的基因序列

8、全長(zhǎng)共2125bp,編碼699個(gè)氨基酸殘基,分子量為80.37kDa,等電點(diǎn)為6.48。與美國(guó)鹵蟲的相似性達(dá)到99％。對(duì)其序列的保守功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)proPO含有一個(gè)蛋白酶切位點(diǎn)推測(cè)位于Arg75-Gly76,2個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)1個(gè)硫羥酸酯結(jié)構(gòu)域。2個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn)(CuA和CuB)內(nèi)含有六個(gè)高度保守的組氨酸殘基(位于氨基酸225,229,251和379,383,419處)。1個(gè)硫羥酸酯結(jié)構(gòu)域(GCGWPEHM)位于氨基酸

9、592-599處,也高度保守。通過(guò)分析得知中國(guó)鹵蟲proPO無(wú)信號(hào)肽序列。對(duì)其二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其銅離子保守結(jié)構(gòu)區(qū)為α-螺旋結(jié)構(gòu)。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn),鹵蟲遠(yuǎn)離其他十足目甲殼動(dòng)物,與水蚤形成甲殼動(dòng)物的另一進(jìn)化分支。
　　 以鹵蟲β-actin基因?yàn)閮?nèi)參,以獲得的proPO基因序列設(shè)計(jì)特異性引物,利用半定量RT-PCR方法對(duì)中國(guó)鹵蟲5個(gè)不同發(fā)育時(shí)期(0h,6h,E(E),Instar Ⅰ和InstarⅡ期)proPO基因的轉(zhuǎn)錄表

10、達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)鹵蟲的proPO基因從E期開(kāi)始出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄表達(dá),從E期到InstarⅡ期的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。同時(shí)對(duì)這5個(gè)不同發(fā)育時(shí)期鹵蟲的PO活性進(jìn)行了檢測(cè),發(fā)現(xiàn)只有InstarⅡ期幼蟲才有明顯的PO活性。說(shuō)明鹵蟲proPO轉(zhuǎn)錄本與PO酶活性的表達(dá)變化在胚胎發(fā)育過(guò)程中受到了調(diào)控。
　　 本文比較研究了弧菌侵染、餌料營(yíng)養(yǎng)與免疫成分刺激及熱激蛋白對(duì)鹵蟲免疫機(jī)制的影響作用,對(duì)進(jìn)一步了解目前仍不詳細(xì)的甲殼動(dòng)物的免疫機(jī)制奠定了一定的