快速檢測食品中觸酶陽性菌生物傳感法的建立.pdf

1、食品中有害微生物的污染仍是影響食品安全的重要因素。據(jù)現(xiàn)有報道，由腹瀉相關(guān)的疾病可導(dǎo)致全球數(shù)以百萬人的死亡，且其中70％的腹瀉病與食品及飲用水的細菌污染有關(guān)。在食品原料及產(chǎn)品中常易發(fā)現(xiàn)的大部分細菌為觸酶陽性菌，主要包括大腸埃希氏菌、李斯特氏菌、沙門氏菌、副溶血弧菌和金黃色葡萄球菌等食源性致病菌。因此建立分析檢測食品中的致病菌及腐敗菌的技術(shù)是食品工業(yè)中保證食品質(zhì)量及安全的重要手段。傳統(tǒng)的檢測細菌的方法主要依賴于分離培養(yǎng)及鑒定技術(shù)，但這些技術(shù)

2、過程繁瑣，耗時長，不適合現(xiàn)場檢測。為滿足現(xiàn)場快速、高效檢測需求，本文建立了四種檢測觸酶陽性菌的生物傳感方法，并對其檢測性能進行了評價。研究過程及結(jié)果概括如下：
　　1.檢測觸酶陽性菌的光電型生物傳感方法的建立：鹽酸鄰聯(lián)甲苯胺（顯色劑）-辣根過氧化酶（HRP）固定化在特制的試紙條上，將含有觸酶陽性菌的樣品與H2O2混合后加在試紙條上發(fā)生顯色反應(yīng)。觸酶陽性菌本身產(chǎn)生的過氧化氫酶可分解 H2O2，剩余 H2O2與樣品中觸酶陽性菌含量呈負

3、相關(guān)，與顯色反應(yīng)強度呈正相關(guān)。將試紙條插入光電型生物傳感儀中，單色光照射，采集紅色反射光并將其轉(zhuǎn)化為電信號，建立間接快速檢測觸酶陽性菌的光電型生物傳感方法。結(jié)果表明：在pH=6環(huán)境下，選用5 mmol/L H2O2溶液與樣品液混合，在試紙條上反應(yīng)60秒，檢測觸酶陽性菌范圍在103~109 CFU/mL，lg CFU與光強抑制率呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，滿足線性方程y=-0.904/1+e(x-6.777)/0.379+0.952,r2=0.9

4、88，檢測時間少于2分鐘，試紙條4℃下保存半年。與分光光度法比較，測試結(jié)果相近（P>0.05），檢測時間縮短。該方法簡單、靈敏，可實現(xiàn)觸酶陽性菌現(xiàn)場快速檢測。
　　2.檢測觸酶陽性菌的化學發(fā)光生物傳感方法的建立：將含有魯米諾-H2O2-HRP-四苯硼鈉（增強劑）反應(yīng)液的測試杯放入自行制備的化學發(fā)光生物傳感儀中，含有觸酶陽性菌的樣品會消耗反應(yīng)液中H2O2抑制化學發(fā)光反應(yīng)，通過微處理器將該反應(yīng)產(chǎn)生的光信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，建立一種快速檢

5、測觸酶陽性菌的化學發(fā)光法。結(jié)果表明：在pH=8.5的B-R介質(zhì)中，檢測范圍在103~109 CFU/mL, lg CFU與光強抑制率呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，滿足線性回歸方程y=-0.983/1+e(x-7.22)/0.631+1.055,r2=0.992。HRP濃度為0.5×10-4 g/L，適宜反應(yīng)時間為5分鐘，檢測時間在10分鐘以內(nèi)。與RFL-1型超微弱化學發(fā)光檢測儀比較，無顯著差異（P>0.05）。該方法靈敏且可同時測試多個樣品，為大

6、規(guī)?？焖贆z測觸酶陽性菌提供有力的手段。
　　3.檢測觸酶陽性菌的電流型生物傳感方法的建立：將自行制作的絲網(wǎng)印刷電極用殼聚糖-辣根過氧化物酶進行修飾，然后將其通過與便攜式電流儀相連。在測試細菌時，將細菌、過氧化氫與鹽酸鄰聯(lián)甲苯胺的反應(yīng)產(chǎn)物滴加到絲網(wǎng)印刷電極的反應(yīng)區(qū)，并在該傳感器上使用0.55伏的激勵電壓，以電流儀上顯示的電流值為傳感信號，從而建立一種快速檢測觸酶陽性菌的電流型生物傳感法。結(jié)果表明：pH=6.5環(huán)境下，檢測范圍在104

7、~108 CFU/mL, lg CFU與電流響應(yīng)值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，滿足線性方程y=-3.29x+31.79，r2=0.997，反應(yīng)時間為10分鐘,電極條可于4℃下保存半年。與CHI630C電化學分析儀比較，測試結(jié)果無顯著差異（P>0.05）。該方法樣品處理簡單、成本低，制成的一次性電極條具有小型化、智能化的優(yōu)點，可滿足現(xiàn)場實時檢測需求。
　　4.基于熒光素酶反應(yīng)體系特異性檢測食品中大腸桿菌及沙門氏菌生物傳感法的建立：利用多價血

8、清特異性結(jié)合一類細菌，加入提取劑釋放出細菌體內(nèi)的ATP，通過熒光素酶體系檢測ATP含量，將反應(yīng)產(chǎn)生的光信號轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，建立一種特異性檢測觸酶陽性菌的生物傳感法。結(jié)果表明：經(jīng)0.025%癸甲溴銨提取，緩沖液 pH=7.8環(huán)境下，檢測范圍在103~108 CFU/mL，且lg CFU與發(fā)光強度響應(yīng)值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。檢測大腸桿菌擬合方程為y=-121.1/1+e(x-6.22)/0.61+129.9,r2=0.986，沙門氏菌擬合方程