溫度和pH雙敏感納米凝膠的制備及其抗乳腺癌協(xié)同機制研究.pdf

1、5-氟尿嘧啶(5-FU)是一種尿嘧啶類似物，通過抑制脫氧胸苷酸合成酶以及插入RNA和DNA而干擾核苷代謝，對細胞產(chǎn)生毒性，引起細胞死亡，被廣泛應(yīng)用于乳腺癌的治療。然而，其強烈毒副作用的出現(xiàn)，極大限制了5-FU的臨床療效。因此，亟待探索治療新策略。
　　納米醫(yī)藥的興起有望解決傳統(tǒng)化療存在的問題。作為廣泛應(yīng)用的納米材料之一，納米凝膠是一種能夠被水溶脹的、具有三維鉸鏈網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的納米級高分子聚集體，其多孔的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，不但能顯著增強凝膠體系

2、的體內(nèi)外穩(wěn)定性，且能負載大量親水性生物活性藥物，成為遞送親水性化療藥物5-FU的最佳載體。此外，通過引進功能性單體獲得具有刺激響應(yīng)性的凝膠，即智能納米凝膠。其中，聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAM)已被大量用于構(gòu)建溫度響應(yīng)性納米載藥體系，其體積相轉(zhuǎn)變溫度(VPTT)約為32℃，基于PNIPAM的凝膠能夠隨著溫度的變化發(fā)生微觀結(jié)構(gòu)和性能的轉(zhuǎn)變。然而，對于該溫敏凝膠藥物遞送系統(tǒng)在細胞水平的機制研究很少。我們知道，陽離子聚乙烯亞胺(PEI)因

3、其可逆質(zhì)子化鏈，不僅能夠有效穿過雙層磷脂膜結(jié)構(gòu)，還具有pH響應(yīng)性，適用于研究納米體系在細胞水平的機制。因此，本課題中，我們利用自由基接枝共聚合反應(yīng)并通過在線(in-situ)自組裝制備了具有溫敏PNIPAM內(nèi)核和pH敏感PEI外殼的雙敏感智能納米凝膠[Poly(N-isopropyl acrylamide-g-ethylene amine)，PNIPAM-g-PEI]。動靜態(tài)光散射儀、Zeta電位儀和透射電鏡的輔助數(shù)據(jù)進一步確認該納米凝

4、膠具有規(guī)整的核殼結(jié)構(gòu)和可被精細調(diào)節(jié)的表面物化特性，隨著PEI鏈的增加，該納米凝膠的VPTT從32℃提高到了39℃。體內(nèi)外研究表明，該智能納米凝膠是負載水溶性藥物5-FU（5-FU-gel）的有效載體，因其溫敏被動靶向功能而特異高效地富集在腫瘤部位，使胞內(nèi)藥物濃度增高，對乳腺癌的療效顯著、持久。
　　我們以乳腺癌細胞系MDA-MB-231為靶細胞，深入探索載藥納米凝膠誘導腫瘤細胞死亡的方式及其胞內(nèi)水平相關(guān)機制。CCK-8檢測的增殖抑

5、制結(jié)果表明，5-FU-gel能顯著抑制MDA-MB-231細胞的增殖;且隨著孵育溫度從37℃(T＜VPTT)升高到40℃(T＞VPTT)，細胞對納米凝膠體系的內(nèi)吞量明顯增加，證實基于PNIPAM的溫敏被動靶向功能。研究表明，納米體系的胞內(nèi)路徑主要是內(nèi)涵體-自噬體-溶酶體，我們在激光共聚焦掃描顯微鏡(CLSM)下通過熒光共定位和自噬相關(guān)蛋白LC-3的檢測來追蹤凝膠體系的胞內(nèi)路徑，并利用3-甲基腺嘌呤(3-MA)和氯喹(CQ)來調(diào)節(jié)相關(guān)細胞

6、器的形成。結(jié)果顯示，納米凝膠主要富集于溶酶體，聯(lián)合3-MA抑制自噬的起始步驟后主要富集于內(nèi)涵體，而聯(lián)合CQ抑制自噬下游步驟后主要富集于自噬體。另一方面，CCK-8檢測結(jié)果顯示5-FU-gel、5-FU-gel+CQ、5-FU-gel+3MA對乳腺癌細胞的殺傷能力依次降低，提示溶酶體是載藥納米凝膠發(fā)揮作用的主要細胞器。我們進一步研究了可質(zhì)子化的PEI是否會引起溶酶體依賴的相關(guān)機制。通過檢測溶酶體結(jié)合膜蛋白LAMP-2及組織蛋白酶B，發(fā)現(xiàn)5

7、-FU-gel的PEI鏈在溶酶體中酸性pH環(huán)境下發(fā)生質(zhì)子化，利用質(zhì)子海綿效應(yīng)使納米凝膠溶脹，大量釋放所負載的5-FU，抑制靶細胞核苷酸的生物合成，從而殺傷靶細胞;同時，強質(zhì)子化后的PEI鏈能破壞溶酶體膜，使組織蛋白酶B彌散至胞質(zhì)中，引起下游信號通路的激活。經(jīng)FITC-AnnexinⅤ和PI雙染后，用流式細胞術(shù)檢測意外地發(fā)現(xiàn)，5-FU-gel能夠誘導MDA-MB-231細胞凋亡，且孵育溫度為40℃時的凋亡程度比37℃時更加明顯。通過CLS

8、M觀察線粒體膜電位變化和細胞色素c釋放情況，并用western blot技術(shù)檢測caspase-9蛋白表達水平，進一步發(fā)現(xiàn)5-FU-gel引起線粒體膜電位下降、細胞色素c釋放和caspase-9蛋白表達量增加，說明5-FU-gel誘導的細胞凋亡是線粒體介導的caspase依賴性的凋亡。
　　綜上所述，溫度和pH雙敏感納米凝膠可通過溫敏內(nèi)核促進其被腫瘤細胞攝取，具有被動靶向功能;同時，我們率先研究發(fā)現(xiàn)，其質(zhì)子化的PEI外殼不但能大量