紫外光（UV-B）對金絲桃細胞中黃酮類次生產(chǎn)物合成的影響及其信號轉導機理研究.pdf

1、高等植物是植物藥等天然活性物質的重要來源。雖然植物是一種可再生資源,但是由于受到栽培困難、生長速度慢、無計劃采伐以及近年來對天然活性物質要求不斷增加等因素的影響使某些植物天然產(chǎn)物的供需矛盾日益突出。利用細胞全能性原理發(fā)展起來的植物細胞培養(yǎng)技術為植物天然活性物質的生產(chǎn)提供了一條全新途徑。但目前制約該項技術產(chǎn)業(yè)化應用的核心問題之一是普遍存在的培養(yǎng)細胞中活性物質的低產(chǎn)現(xiàn)象,因此提高培養(yǎng)細胞代謝產(chǎn)物含量已經(jīng)成為決定細胞培養(yǎng)技術能否實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關

2、鍵因素。 中波紫外輻射(UV-B,280～320nm)對植物的影響是近年來的研究熱點,低濃度的紫外線能誘導植物的多種反應,其中類黃酮物質的快速積累是許多植物對UV-B處理的常見早期反應之一。因此,利用UV-B處理植物細胞可以誘發(fā)黃酮次生物質的合成積累,并成為提高植物培養(yǎng)細胞次生物質產(chǎn)量的有效手段之一。然而,目前對UV-B誘發(fā)植物細胞黃酮類次生物質合成積累的詳細機制尚不十分了解。 本文以本實驗室構建保存的金絲桃細胞為材料,

3、測定了UV-B對金絲桃中黃酮類物質合成的影響,在確定UV-B對金絲桃細胞中類黃酮合成積累具有促進作用的基礎上,進一步研究探討了UV-B誘發(fā)金絲桃細胞中黃酮類物質合成的信號轉導機理,主要實驗結果如下： 1、金絲桃懸浮細胞系的建立和優(yōu)化。將固體培養(yǎng)的金絲桃愈傷組織接種到MS培養(yǎng)液中,為獲得最優(yōu)細胞生物量和黃酮含量,對培養(yǎng)液成分(植物激素組成、pH值和蔗糖濃度)、培養(yǎng)溫度、搖床轉速和接種量等條件進行優(yōu)化,得到了金絲桃懸浮細胞系的最適培

4、養(yǎng)條件：培養(yǎng)液為MS+1.5×10-5mol·L-1 NAA+10-6mol·L-1 BA+3％蔗糖,使用前pH值調(diào)至5.8,培養(yǎng)溫度為25℃,搖床轉速為100rpm,接種量為3g/50mL medium。并且在此培養(yǎng)條件下測得細胞生長周期為2周。在優(yōu)化培養(yǎng)條件的過程中,對傳代種細胞進行篩選,最終獲得了生長速度較快、形態(tài)比較穩(wěn)定的金絲桃懸浮細胞系。 2、紫外光(UV-B)對金絲桃細胞中黃酮類物質合成積累的影響。將培養(yǎng)了5d的生長

5、旺盛的金絲桃細胞用UV-B處理后測定金絲桃細胞的生長量和黃酮類物質的含量,結果顯示處理后5h到30h內(nèi),雖然金絲桃細胞的生長量沒有顯著變化,但黃酮的產(chǎn)量大幅提高,表明UV-B處理可以誘發(fā)金絲桃細胞中黃酮類物質合成積累。 3、NO參與UV-B對金絲桃細胞中黃酮類物質合成積累。數(shù)據(jù)表明UV-B處理后金絲桃細胞中一氧化氮(NO)的含量大幅增加；通過加入NO的專一性淬滅劑cPTIO和一氧化氮合酶抑制劑PBITU,發(fā)現(xiàn)它們不僅能抑制UV-

6、B誘導的NO的產(chǎn)生還能抑制UV-B觸發(fā)的黃酮類物質的積累,表明UV-B處理可以激活金絲桃細胞中NO信號事件,而且還依賴NO信號分子誘發(fā)金絲桃中黃酮類物質的合成積累。 4、H2O2是UV-B誘發(fā)金絲桃細胞中黃酮類物質合成積累必需的信號分子。實驗結果顯示UV-B處理后金絲桃細胞中過氧化氫(H2O2)的含量大幅增加；通過加入過氧化氫酶CAT和質膜NAD(P)H氧化酶抑制劑DPI,發(fā)現(xiàn)這兩者不僅能抑制UV-B誘導的H2O2的產(chǎn)生還能抑制

7、UV-B觸發(fā)的黃酮類物質的積累,表明UV-B處理還可以激活金絲桃細胞中H2O2信號事件,而且H2O2信號分子也是參與UV-B誘發(fā)金絲桃中黃酮類物質合成積累所必需的信號分子之一。 5、H2O2對NO誘發(fā)金絲桃細胞中黃酮類物質合成積累中的增效作用。以外源H2O2和NO分別處理金絲桃細胞,并測定細胞中黃酮類物質的含量,結果表明NO單獨處理能夠增加黃酮類物質的合成而H2O2對其產(chǎn)量沒有影響：但同時加入H2O2和NO時比只用NO處理的金絲

8、桃細胞中黃酮產(chǎn)量高,說明H2O2本身對黃酮合成沒有影響,但能夠加強NO對金絲桃細胞中黃酮類物質合成的積累,表明H2O2對NO誘發(fā)金絲桃細胞中黃酮類物質合成積累中有增效作用。 6、H2O2和NO的信號互作。實驗結果表明,H2O2處理可以提高細胞中一氧化氮合酶(NOS)的活性并誘發(fā)細胞中NO合成,說明H2O2可以催化細胞中NO合成積累；而NO處理也可以提高細胞中H2O2水平,說明NO對細胞中H2O2的合成積累也具有促進作用。試驗結果

9、表明H2O2和NO信號分子之間存在著一種特殊的互催化信號放大作用,揭示了金絲桃細胞中NO和H2O2之間一種新的信號互作用現(xiàn)象。 7、H2O2對NO誘發(fā)的金絲桃細胞中黃酮類物質合成積累的增效作用依賴于兩種信號分子之間的互催化反應。DPI和PBITU不僅能夠抑制H2O2和NO之間的互催化反應,而且還能抑制H2O2對NO誘發(fā)黃酮類物質合成積累的增效作用,表明H2O2對NO誘發(fā)黃酮類物質合成積累的增效作用可能依賴于兩種信號分子之間的互催

10、化反應。 8、NO和H2O2通過不同的機制介導UV-B誘發(fā)的金絲桃細胞中黃酮類物質合成積累。UV-B可以誘導細胞中黃酮類次生物質生物合成途徑的第一個關鍵酶CHS基因的表達上調(diào),NO淬滅劑cPTIO可以抑制UV-B誘發(fā)的CHS表達,但H2O2淬滅劑CAT對UV-B誘發(fā)的CHS表達無影響,說明NO介導UV-B誘發(fā)黃酮類物質合成積累與CHS基因的表達活化有關,而H2O2介導的UV-B誘發(fā)黃酮類物質合成積累與CHS基因的表達活化無關。因