宰后牛肉成熟過程中肌細(xì)胞死亡生理研究.pdf

1、動物宰殺放血后,骨骼肌細(xì)胞在缺乏營養(yǎng)基質(zhì)以及氧氣供應(yīng)下,鈣離子濃度迅速升高,ATP類能量物質(zhì)迅速降解,pH值在宰后一段時間內(nèi)也顯著下降。隨著成熟時間的延長,這些細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的變化,細(xì)胞肯定會啟動某種死亡程序,但究竟是哪一種程序,該程序?qū)υ缀笈Ｈ饧〖?xì)胞亞細(xì)胞功能結(jié)構(gòu),以及宏觀品質(zhì)有怎樣重要的影響,目前還是未知數(shù).至于細(xì)胞死亡發(fā)生在宰后的哪一個階段,對應(yīng)的有哪些生化反應(yīng),也不清楚。弄清這些問題,有利于我們對宰后肌肉轉(zhuǎn)化成肉的過程中肉品品質(zhì)變化

2、機制的進(jìn)一步理解。本文對三種不同部位牛肉的宰后細(xì)胞內(nèi)環(huán)境變化,成熟過程中肌細(xì)胞的死亡方式進(jìn)行了研究,對宰后不同階段的細(xì)胞凋亡進(jìn)行了定量,探索了凋亡酶caspase-3的活化及活化途徑,并對caspases及細(xì)胞凋亡與牛肉嫩度變化之間的聯(lián)系進(jìn)行了探討。
　　 1.牛肉bcl-2家族蛋白表達(dá)及宰后能量水平變化
　　 牛肉腰小肌(PM)、背最長肌(LM)和半腱肌(STN)的肌纖維類型構(gòu)成存在顯著差異,其中有氧代謝型纖維的比例腰

3、小肌>背最長肌>半腱肌(p<0.05).我們通過western blotting檢測出35kDa的內(nèi)參GAPDH蛋白,25kDa的bcl-2蛋白,22kDa的bax蛋白和23kDa bad蛋白.統(tǒng)計分析顯示,STN肌肉中bax和bcl-2蛋白的表達(dá)顯著低于PM肌肉(p<0.05)；而STN肌肉中bad蛋白的表達(dá)顯著高于LM肌肉,LM肌肉的bad蛋白表達(dá)又要顯著高于PM肌肉(p<0.05).在宰后30min到3h和宰后8h到14hPM肌肉

4、和LM肌肉的ATP含量顯著下降(p<0.0001),STN肌肉的ATP含量在宰后30min到5h和宰后8h到14h顯著下降(p<0.0001).三種肌肉的pH值宰后迅速下降,ATP在宰后第14h顯著降低,且能量代謝在18h內(nèi)完成.pH值的迅速下降將會形成一個對caspases活化和凋亡發(fā)生有利的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,而ATP宰后14h的分解則會抑制caspases的活化。
　　 2.牛肉肌細(xì)胞形態(tài)變化以及細(xì)胞凋亡率的研究
　　 隨

5、著貯藏時間的延長,牛肉肌細(xì)胞線粒體開始腫脹,部分脊突被清除呈空泡狀,最后皺縮；細(xì)胞核染色質(zhì)開始濃縮及邊緣化,小的核顆粒被包裹成細(xì)胞凋亡的典型特質(zhì)的類凋亡小體,最后呈現(xiàn)出繼發(fā)性壞死的高電子密度的核染色質(zhì).TUNEL定量分析表明從第2天開始背最長肌(p<0.05)中的陽性細(xì)胞核呈顯著的線性增多,半腱肌中的凋亡陽性細(xì)胞核在宰后第4天和第7天顯著增多(p<0.05)。這三種肌肉中細(xì)胞核的凋亡數(shù)量在宰后第7天(p<0.05)有著顯著差異,腰小肌的

6、凋亡細(xì)胞核數(shù)量最多,其次是半腱肌,最后是背最長肌。HE、ACP和苔盼藍(lán)陽性染色顯示,細(xì)胞壞死也發(fā)生在宰后的牛肉中,這顯示作為一個組織整體的骨骼肌,內(nèi)部的細(xì)胞骨架蛋白的水解機制以及其他生化變化機制,并不是單一的、一種模式的。
　　 3.宰后牛肉肌細(xì)胞caspase-3的活化及途徑
　　 通過Wetern blotting檢測到細(xì)胞色素 c的14kDa的蛋白條帶,20和18kDa的caspase-3,23kDa的caspas

7、e-9,22kDa的caspase-8活化片斷,PARP被劈開產(chǎn)生了36和24kDa兩個小片段。牛肉背最長肌,半腱肌和腰小肌的胞漿細(xì)胞色素c含量在宰后第1天分別升高了4.5(p<0.0001),7.9(p<0.0001)和7.9倍(p<0.0001),caspase-3(背最長肌,p<0.001,腰小肌,p<0.001,半腱肌,p<0.001),caspase-8(背最長肌,p<0.01,腰小肌,p<0.001,半腱肌,p<0.001)

8、和caspase-9的活力(背最長肌,p<0.001,腰小肌,p<0.001,半腱肌,p<0.001)在第4h顯著升高.宰后三種牛肉的caspase-3活力與caspase-8和caspase-9活力之間呈一定的相關(guān)性.caspase-3的激活是通過兩種途徑共同參與的,一種是caspase-8介導(dǎo)的受體途徑,一種是細(xì)胞色素c和caspase-9介導(dǎo)的線粒體途徑；肌肉之間第1天胞漿細(xì)胞色素c含量差異與促凋亡蛋白bax表達(dá)水平有關(guān)；宰后ca

9、spase-3,-8和-9活力達(dá)到頂點,隨后的顯著降低是由于ATP的消耗引起的.此外,PARP在宰后產(chǎn)生了一個36kDa的降解片斷,這表明calpain介導(dǎo)的細(xì)胞壞死也發(fā)生在宰后牛骨骼肌的成熟過程中.
　　 4.宰后牛肉肌纖維收縮及品質(zhì)變化研究
　　 成熟過程中肌肉的剪切力值在第4天顯著下降(腰小肌,p<0.01；背最長肌,p<0.01；半腱肌,p<0.05),肌原纖維小片化指數(shù)第4天和第7天顯著升高(腰小肌,p<0.0

10、1；背最長肌,p<0.05；半腱肌,p<0.01).背最長肌和腰小肌的細(xì)胞間隙面積宰后第1天和第2天一直增加.宰后三種肌肉的肌節(jié)長度在第2天顯著縮短,肌纖維超微結(jié)構(gòu)在宰后貯藏過程中分別受到了不同程度的破壞.宰后三種肌肉的亮度值(L*)、紅度值(a*)和黃度值(b*)在早期顯著升高,紅度值(a*)和黃度值(b*)隨后顯著下降.牛肉的剪切力值與caspase-3,-8和-9活力存在一定的正相關(guān)關(guān)系；腰小肌和背最長肌的細(xì)胞凋亡量與肌原纖維指數(shù)